Khám phá về EV
Khoa học và y học đã luôn đi đầu trong một số khám phá hấp dẫn nhất trong lịch sử. Lấy ví dụ, câu chuyện về việc nấm mốc Penicillium tình cờ rơi vào một đĩa thạch chứa vi khuẩn, dẫn đến phát hiện ngẫu nhiên về kháng sinh. Một câu chuyện đáng chú ý khác là của Barry Marshall, người đã tự đưa vi khuẩn Helicobacter pylori vào cơ thể mình để chứng minh ảnh hưởng của nó đến loét dạ dày. Thí nghiệm mạo hiểm này cuối cùng đã mang về cho ông giải Nobel, thể hiện sức mạnh của việc học hỏi thông qua thực nghiệm.
Chúng ta cũng không thể quên người phụ nữ phi thường – Marie Curie, người từng mang theo các ống nghiệm chứa radium trong túi áo. Đáng buồn thay, việc tiếp xúc với phóng xạ khiến bà mắc bệnh bạch cầu, trở thành một bài học đắt giá từ sai lầm. Những giai thoại này làm nổi bật hành trình tuyệt vời của sự tò mò khoa học.
Câu chuyện về các túi ngoại bào (extracellular vesicles – EVs) cũng giống như một hành trình tò mò khoa học vượt qua nhiều lĩnh vực khác nhau như huyết học, sinh học tế bào, virus học và nhiều hơn thế nữa. Những lĩnh vực đa dạng này cuối cùng đã hội tụ để khám phá sự tồn tại của những túi nhỏ có hoạt tính sinh học này. Kiến thức thu thập được từ mỗi lĩnh vực đã đóng vai trò quan trọng trong việc làm sáng tỏ tầm quan trọng của EVs như một thành phần thiết yếu trong sinh lý học của chúng ta.
Mặc dù là một khám phá tương đối gần đây, EVs đã thu hút sự quan tâm lớn trong lĩnh vực khám phá sinh học. Nhiều nhà khoa học hiện đang tập trung vào việc tìm hiểu sự đa dạng của EVs, vai trò của chúng trong các chức năng sinh lý, và khả năng liên quan của chúng đến nhiều loại bệnh.
Vào những năm 1930, một nhà sinh hóa tên là Chargaff đã nghiên cứu phát triển một giao thức ly tâm để tách các yếu tố đông máu khỏi máu. Trong quá trình này, ông quan sát thấy rằng việc thêm chất lắng tốc độ cao vào huyết tương ở phần trên làm rút ngắn đáng kể thời gian đông máu (1). Quan sát này đã làm sáng tỏ sự tồn tại của EVs, một nhóm phân tử sinh học riêng biệt có trong máu. Với sự hỗ trợ của West (2), họ đã xác định thêm một “phần dạng hạt” lắng ở 31.000 xg và thể hiện tiềm năng đông máu cao và đặc tính tạo huyết khối – bao gồm EVs. Ban đầu, người ta đưa ra giả thuyết rằng các phần riêng biệt này bao gồm nhiều sản phẩm phân hủy nhỏ khác nhau của các tế bào máu. Tuy nhiên, phải mất gần hai thập kỷ nghiên cứu nữa để xác định và phân biệt vật liệu ở dạng hạt nhỏ, có thể lắng đọng bằng cách ly tâm tốc độ cao và có nguồn gốc từ tiểu cầu nhưng khác biệt với tiểu cầu nguyên vẹn. Những phát hiện này phù hợp chặt chẽ với các đặc điểm của EVs (3). Những hình ảnh từ kính hiển vi điện tử đầu tiên về “bụi tiểu cầu” này đã cung cấp cho các nhà khoa học cái nhìn trực quan về hình dạng thực sự của EVs (Hình 1).
Tổng quan về EVs:
- Các túi ngoại bào (EV) có màng phospholipid thường có độ dày khoảng 5 nm.
- Các túi này có nhiều kích cỡ khác nhau, trong đó hầu hết các chất lỏng đều chứa EV có kích cỡ khác nhau.
- Kích thước tối thiểu của EV phụ thuộc vào thành phần của chúng và dao động từ 30-50 nm trong huyết tương ở người.
- Nhìn chung, phân bố kích thước của EV có đỉnh dưới 200 nm.
- Trong máu người, các EV hình cầu có kích thước nhỏ hơn 500 nm chiếm khoảng 95% tổng số.
Hình 1. Đặc điểm của EV nước tiểu (uEV) bằng kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM). Hình ảnh đại diện về đặc điểm TEM của uEV được phân lập bằng phương pháp siêu ly tâm. Bertolone et al. Front. Endocrinol. 2023 14:1096441. Xuất bản theo Giấy phép Creative Commons Attribution 4.0 Quốc tế: http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/
Ban đầu được gọi là exosome (các vi nang nhỏ), thuật ngữ “các túi ngoại bào” được chính thức thông qua vào năm 2011 để định nghĩa các cấu trúc không sao chép này được bao bọc bởi một lớp lipid kép. Cùng năm đó chứng kiến sự thành lập của Hiệp hội các túi ngoại bào quốc tế (ISEV), nơi đã phát triển các hướng dẫn (MISEV) để chuẩn hóa việc phân tích và báo cáo nghiên cứu EV (8). Kể từ đó, nhiều chủ đề đã xuất hiện, bao gồm nghiên cứu về vận chuyển hàng hóa, dấu ấn sinh học, ung thư, bệnh tim mạch, bệnh truyền nhiễm, phân phối thuốc và nhiều chủ đề khác. Các lĩnh vực nghiên cứu này làm nổi bật tầm quan trọng to lớn của EV trong nhiều lĩnh vực nghiên cứu khác nhau.
Tầm quan trọng của EV trong khoa học và y học
Việc phát hiện ra thế giới của các túi ngoại bào (EV) đã làm sáng tỏ những khía cạnh trước đây chưa được biết đến về cách cơ thể hoạt động, cách các tế bào ung thư lây lan và cách các tác nhân gây bệnh phát tán. Tuy nhiên, vẫn còn nhiều cuộc điều tra cần thiết để giải mã hoàn toàn những bí mật của EV. Các nhà khoa học hiện nay nhận ra rằng EV đóng vai trò trung tâm không chỉ trong các quá trình sinh lý mà còn trong các tình trạng bệnh lý. Sự công nhận này đã dẫn đến sự gia tăng đáng kể trong nghiên cứu trong thập kỷ qua, với hàng nghìn bài báo khoa học được công bố chỉ riêng trong năm 2022 (Hình 2).
Hình 2: Số lượng ấn phẩm liên quan đến túi ngoại bào (EV). Hình này biểu thị số lượng ấn phẩm được lấy từ năm 1950 đến nay, sử dụng từ khóa “túi ngoại bào” (nguồn: Pubmed.com).
‘
EV được sản xuất bởi tất cả các loại tế bào trên khắp các thế giới sự sống. Quá trình sinh tổng hợp của chúng có thể được phân loại thành hai loại giải phóng: (i) nảy chồi từ màng tế bào, tạo ra các vi nang lớn hơn và các thể chết rụng theo chương trình, và (ii) giải phóng các túi có nguồn gốc từ nội thể (9). EV có kích thước nhỏ (dao động từ 30 đến 500 nm) và sở hữu một vùng nội bào. Do kích thước và khả năng mang protein và axit nucleic của chúng, các nhà khoa học tập trung vào việc tìm hiểu chức năng của chúng và khám phá tiềm năng của chúng như các dấu ấn sinh học.
Nghiên cứu đã chỉ ra rằng EV đóng vai trò trong nhiều quá trình sinh lý khác nhau, bao gồm sự hình thành mạch máu, di chuyển tế bào và truyền tín hiệu tế bào-tế bào. Sự phong phú và khả năng dễ dàng xâm nhập vào các tế bào đích cho thấy sự tham gia của chúng vào nhiều quá trình sinh lý, cả trong tuần hoàn ngoại vi và mô (Hình 3). Trên thực tế, EV có khả năng vượt qua hàng rào máu não, cho thấy vai trò tiềm tàng trong các bệnh thoái hóa thần kinh (10). Ngoài ra, EV có thể đóng vai trò là dấu ấn sinh học cho các công cụ sàng lọc ngoại vi trong các bệnh như Alzheimer (cùng với các ứng dụng khác) (11).
Ngày càng có nhiều sự quan tâm đến tiềm năng điều trị của EV. Các thử nghiệm lâm sàng đang điều tra việc sử dụng EV như phương tiện vận chuyển hàng hóa để đưa hợp chất đến các tế bào mục tiêu. Bằng cách thiết kế EV để biểu hiện các dấu hiệu cụ thể, chúng có thể được nhắm mục tiêu đến các vị trí cụ thể trong cơ thể và đưa hàng hóa vào bên trong các tế bào. Việc đưa thuốc có mục tiêu này mang lại những lợi thế về mặt tính đặc hiệu so với các phương pháp đưa thuốc thông thường. Các protein xuyên màng như tetraspanin (ví dụ: CD9, CD63, CD81), thường được sử dụng làm dấu hiệu của EV, cũng đóng một vai trò trong quá trình này (12). Khi đã vào bên trong tế bào, hàng hóa tương tác với các thành phần nội bào, ảnh hưởng đến các con đường truyền tín hiệu và cuối cùng dẫn đến các kết quả mong muốn như kích hoạt, ức chế hoặc điều chỉnh các chức năng của tế bào.
Quá trình sinh lý liên tục này, trong đó EV điều chỉnh các chức năng tế bào từ bên trong, tác động đến sự tương tác của các tế bào mục tiêu với môi trường vi mô của chúng, đặc biệt là trong các mô. Thông qua việc giải phóng EV, một số tế bào ung thư có thể lan sang các mô khác, vì các túi này có khả năng điều chỉnh môi trường vi mô của mô theo hướng có lợi cho sự phát tán của tế bào ung thư (13). Lĩnh vực nghiên cứu này rất năng động, vì việc tìm ra cách ngăn chặn hành động này có khả năng làm giảm sự lây lan của các tế bào ung thư khắp cơ thể (14).
EV được tạo ra như thế nào:
- EV có nguồn gốc từ hệ thống nội thể, dẫn đến sự hình thành các thể đa nang.
- Những EV này mang protein có nguồn gốc từ tế bào trên bề mặt của chúng.
- Sau đó, chúng được vận chuyển đến màng tế bào và hợp nhất với màng tế bào.
- Sau khi hợp nhất, chúng được giải phóng khỏi tế bào vào không gian ngoại bào.
- Sau đó, EV có thể liên kết với các tế bào đích biểu hiện thụ thể tương ứng mà chúng biểu hiện.
- Một khi đã vào bên trong tế bào mục tiêu, chúng có khả năng giải phóng hàng hóa của mình.
Hình 3: Sinh tổng hợp các túi từ tế bào và sự neo đậu của chúng vào các tế bào đích. EV và thành phần phân tử của chúng được bao bọc trong các thể vi nang (MVB) di chuyển đến màng tế bào để giải phóng vào không gian ngoại bào.
Ly tâm là khởi nguồn của khám phá EV
Nghiên cứu về các túi ngoại bào (EV) và sự phát triển của lĩnh vực EV đã phụ thuộc rất nhiều vào các giao thức ly tâm kể từ khám phá ban đầu của Chargaff. Trong nhiều năm, các nhà khoa học đã cải tiến các giao thức để làm giàu, phân lập lập và mô tả đặc điểm của EV. Giao thức phân tách lý tưởng sẽ mang lại năng suất cao, tính không đồng nhất và hiệu quả trong khi giảm thiểu thời gian và chi phí. Ly tâm, là một kỹ thuật đã được thiết lập tốt trong các phòng thí nghiệm, là phương pháp được lựa chọn đã đưa lĩnh vực này đến trạng thái hiện tại. Có nhiều phương pháp khác nhau để phân lập EV và các ứng dụng hạ nguồn cụ thể quyết định giao thức phù hợp để sử dụng, mỗi phương pháp đều có ưu điểm và nhược điểm riêng (15). Các chất dịch cơ thể như huyết tương, huyết thanh, nước tiểu, dịch não tủy và sữa thường được sử dụng làm nguyên liệu đầu vào để tách EV.
Siêu ly tâm, bao gồm cả ly tâm vi sai, là một phương pháp phân lập được sử dụng rộng rãi cho EV. Mặc dù có thể sử dụng kết hợp các kỹ thuật, nhưng ly tâm hầu như luôn được đưa vào các giao thức phân lập (Hình 4). Ly tâm theo gradient mật độ, lọc và sắc ký loại trừ kích thước đã thu hút sự quan tâm của các nhà nghiên cứu. Tuy nhiên, các phương pháp tinh sạch tiếp theo vẫn liên quan đến siêu ly tâm, ly tâm theo gradient mật độ hoặc các kỹ thuật sắc ký. Tách hạt từ, mặc dù cung cấp một phương pháp tiếp cận có mục tiêu, có thể làm giảm tính không đồng nhất thực sự của EV. Việc phân lập EV đòi hỏi phải loại bỏ các chất gây ô nhiễm và tách EV khỏi các hạt khác, chẳng hạn như chylomicron và lipid, có trong chất lỏng sinh học hoặc môi trường nuôi cấy tế bào (Hình 4). Siêu ly tâm sử dụng lực ly tâm để tách các thành phần dựa trên kích thước và/hoặc mật độ. Các kỹ thuật siêu ly tâm vi sai liên quan đến nhiều vòng quay với tốc độ tăng dần để loại bỏ các chất gây ô nhiễm và EV dạng viên. Siêu ly tâm theo gradient mật độ là một kỹ thuật tinh chế có độ phân giải cao, tách các hạt dựa trên các đặc tính vật lý (kích thước, hình dạng, khối lượng và/hoặc mật độ) bằng cách sử dụng môi trường có mật độ phân loại, chẳng hạn như sucrose hoặc iodixanol. Trong khi siêu ly tâm đệm mật độ tạo ra sự cân bằng giữa thông lượng và độ tinh khiết, siêu ly tâm theo gradient mật độ cung cấp độ tinh khiết cao nhất và siêu ly tâm vi sai cho phép thông lượng cao nhất. Gradient mật độ và siêu ly tâm vi sai tạo ra các mẫu sạch nhất và bảo toàn tính toàn vẹn về mặt cấu trúc của EV so với các phương pháp khác như sắc ký loại trừ kích thước hoặc kết tủa. Vấn đề về khả năng mở rộng, đặc biệt là trong bối cảnh sản xuất và liệu pháp EV, trở nên quan trọng khi quyết định sử dụng phương pháp phân lập nào (16-19).
Hình 4: Phân lập EV liên quan đến việc loại bỏ các chất gây ô nhiễm và tách EV khỏi các hạt khác, chẳng hạn như chylomicron và lipid, có trong chất lỏng sinh học hoặc môi trường nuôi cấy tế bào. Siêu ly tâm sử dụng lực ly tâm để tách các thành phần dựa trên kích thước và/hoặc mật độ của chúng. Các kỹ thuật siêu ly tâm vi sai sử dụng nhiều vòng quay với tốc độ tăng dần để loại bỏ các chất gây ô nhiễm trước rồi sau đó là các EV dạng viên. Siêu ly tâm gradien mật độ là một kỹ thuật tinh chế có độ phân giải cao dựa trên môi trường có mật độ phân loại, chẳng hạn như sucrose hoặc iodixanol, để tách các hạt dựa trên các đặc tính vật lý của chúng như kích thước, hình dạng, khối lượng và mật độ.
Bước tiến mới trong nghiên cứu EV
Từ khi phát hiện ra EV ban đầu cho đến ngày nay, đã có nhiều thập kỷ trôi qua. Điều chú ý gần đây xung quanh EV bắt nguồn từ các ứng dụng tiềm năng có thể nảy sinh từ sự hiểu biết sâu sắc hơn về quá trình tạo ra, điều chỉnh và thao tác của chúng cho mục đích điều trị. Vì EV được tạo ra bởi tất cả các loại tế bào sống và có khả năng điều chỉnh nhiều quá trình, nên khả năng ứng dụng của chúng là vô hạn. Tuy nhiên, điều này cũng nhấn mạnh đến nhu cầu nghiên cứu sâu hơn để làm sáng tỏ những bí mật của EV. Cộng đồng khoa học mong muốn chuẩn hóa việc phân lập, mô tả đặc điểm và sử dụng EV, vì điều này sẽ nâng cao khả năng tái tạo và tạo điều kiện thuận lợi cho việc chuyển đổi các phát hiện thành ứng dụng lâm sàng.
Vẫn còn những đặc điểm quan trọng của EV cần được làm rõ. Đầu tiên, tính không đồng nhất của chúng là một khía cạnh quan trọng cần khám phá. EV không phải là một thực thể đơn lẻ, vì thành phần và kích thước của chúng có thể thay đổi ngay cả trong cùng một tế bào. Việc tạo ra và thành phần của EV có khả năng là các quá trình liên tục được điều chỉnh theo trạng thái của tế bào và các tín hiệu nhận được (Hình 5). Việc mô tả đặc điểm của EV riêng lẻ, có thể đạt được bằng các công nghệ như đo lưu lượng tế bào, sẽ góp phần hiểu rõ hơn về tính không đồng nhất của chúng. Thứ hai, điều quan trọng là phải phát triển các phương pháp có thể mở rộng quy mô để tạo ra EV trong ống nghiệm để cung cấp cho bệnh nhân. Việc xác định quy trình làm việc tiêu chuẩn sẽ rất cần thiết trong vấn đề này và ly tâm đóng vai trò quan trọng trong quy trình sản xuất. Cuối cùng, việc lập bản đồ các dấu hiệu liên quan đến các lớp EV khác nhau (ví dụ: tế bào gốc, tế bào khỏe mạnh so với tế bào ung thư, trạng thái hoạt hóa, dấu hiệu sinh học của bệnh) là cần thiết để đẩy nhanh các nỗ lực điều trị đang diễn ra.
Hình 5: Biểu diễn kích thước và tính không đồng nhất của EV. Lipoprotein tỷ trọng cao (HDL), lipoprotein tỷ trọng thấp (LDL) và lipoprotein tỷ trọng rất thấp (vLDL) được đưa vào để so sánh. Kích thước trung bình của kháng thể, vi-rút và vi khuẩn cũng được hiển thị.
*Chỉ dùng cho mục đích nghiên cứu. Không dùng trong các thủ thuật chẩn đoán.
Dịch từ nguồn: https://www.mybeckman.vn/resources/sample-type/extracellular-vesicles/into-the-world-of-evs
Minh Khang là nhà phân phối và nhập khẩu trực tiếp các Thiết bị ly tâm hãng Beckman Coulter
EN