Tin Tức

Tối ưu hóa phân tích phân cực huỳnh quang Transcreener với Máy đọc đĩa vi tấm SpectraMax ID5

Posted on by Minh Khang
đọc đĩa vi tấm
  • Định dạng trộn và đọc mang lại kết quả mạnh mẽ cho việc sàng lọc thông lượng cao
  • Kỹ thuật đọc tín hiệu huỳnh quang far-red giảm nhiễu hợp chất
  • Giá trị Z’ > 0,7 và Δ mP > 120 đạt được với thời gian đọc dưới 4 phút

Silvia Vidali, PhD | Application Scientist | Molecular Devices

Giới thiệu

Giao thức ứng dụng này mô tả các thông số thiết bị tối ưu được sử dụng để xác nhận Máy đọc đĩa vi tấm đa năng SpectraMax® iD5 với xét nghiệm Transcreener® ADP2 FP từ BellBrook Labs.

Xét nghiệm Transcreener FP là xét nghiệm miễn dịch cạnh tranh để phát hiện trực tiếp các nucleotide với kết quả phân cực huỳnh quang (FP) far-red. Thuốc thử cho tất cả các xét nghiệm là chất đánh dấu far-red liên kết với một kháng thể đơn dòng/đa dòng có độ đặc hiệu cao. Phản ứng enzym tạo ra nucleotide diphosphate hoặc monophosphate đẩy chất đánh dấu ra khỏi kháng thể. Điều này dẫn đến việc tạo ra tín hiệu do sự gia tăng độ tự do quay của chất đánh dấu, được phát hiện là sự giảm độ phân cực, như được mô tả trong Hình 1. Việc sử dụng chất đánh dấu far-red giúp giảm thiểu sự can thiệp từ các hợp chất huỳnh quang và sự tán xạ ánh sáng. Xét nghiệm Transcreener FP được thiết kế dành riêng cho sàng lọc thông lượng cao (HTS) với một lần thêm, định dạng trộn và đọc.

Cụ thể, Xét nghiệm Transcreener ADP2 với đầu đọc FP sử dụng kháng thể chọn lọc ADP qua ATP và chất đánh dấu huỳnh quang. ADP được tạo ra trong phản ứng xét nghiệm cạnh tranh với ADP được đánh dấu bằng chất đánh dấu để liên kết với kháng thể. Do đó, độ phân cực huỳnh quang sẽ giảm khi sản xuất ADP tăng. Phương pháp phát hiện phổ quát này cho phép sàng lọc hầu như bất kỳ enzyme sản xuất ADP nào ở định dạng thông lượng cao.

Máy đọc đĩa vi tấm SpectraMax iD5 cung cấp ống PMT ultra-cooled để giảm tín hiệu nhiễu, cho phép tăng độ nhạy và dải động. Sử dụng các thiết lập được tối ưu hóa cho xét nghiệm Transcreener FP được trình bày trong ghi chú ứng dụng này, SpectraMax iD5 đáp ứng các yêu cầu xác thực của BellBrook Labs.

Hình 1. Minh họa phản ứng enzym Transcreener ADP2 FP (BellBrook Labs). Hoạt động enzym tăng dẫn đến chuyển đổi ATP thành ADP, cạnh tranh với chất đánh dấu để liên kết với kháng thể. Càng có nhiều chất đánh dấu không liên kết, độ phân cực huỳnh quang càng thấp.

Tiêu chí xác thực

Một yếu tố quan trọng trong việc nhận ra những lợi thế của xét nghiệm Transcreener HTS là thiết lập chính xác của máy đọc đĩa vi tấm được sử dụng để đọc dữ liệu. Việc lựa chọn cài đặt thiết bị phù hợp có thể ảnh hưởng đến độ nhạy của thiết bị đối với bất kỳ xét nghiệm nào. Các thông số chính của thiết bị đối với hiệu suất xét nghiệm Transcreener HTS được xác định bằng cách chạy đường chuẩn ATP/ADP 10 μM (24 lần lặp lại), vì các đường chuẩn loại này mô phỏng phản ứng của enzyme. Bắt đầu với 10 μM ATP, ADP được thêm vào với lượng tăng dần và ATP giảm theo tỷ lệ, duy trì nồng độ adenine nucleotide tổng số là 10 μM. Thời gian tích hợp được thay đổi để xác định các yêu cầu tối ưu cho quá trình xác nhận thiết bị. Để xác nhận thiết bị sử dụng với Xét nghiệm Transcreener FP, cần có Z’ > 0,7 và Δ mP > 120 ở mức chuyển đổi 10% của 10 μM ATP.

Nguyên vật liệu

  • Hỗn hợp ATP/ADP trong dung dịch đệm (Đệm: 4 mM MgCl2, 2 mM EGTA, 50 mM HEPES, pH 7,5, 1% DMSO, 0,01% Brij-35). ATP/ADP được kết hợp với nồng độ adenine không đổi là 10 μM.
  • Hỗn hợp phát hiện ADP: 1X đệm dừng và phát hiện B, 4 nM ADP Alexa633 Tracer và 14,8 μg/mL kháng thể ADP2
  • Free Tracer: 1X Stop & Detect Buffer B and 4 nM ADP Alexa633 Tracer
  • Buffer Blank: 1X Stop & Detect Buffer B and 14.8 μg/mL ADP2 Antibody

Phương pháp

Chuẩn bị xét nghiệm

  1. Phân phối 10 μL mỗi tổ hợp ATP/ADP trên toàn bộ một hàng của đĩa 384 giếng (các hàng AO, xem sơ đồ đĩa).
  2. Thêm 10 μL hỗn hợp phát hiện ADP vào các hàng đó.
  3. Nhỏ 10 μL hỗn hợp 10 μM ATP/0 μM ADP vào hàng P.
  4. Nhỏ 10 μL Free Tracer vào các giếng P1-P12.
  5. Nhỏ 10 μL dung dịch đệm trắng vào các giếng P13-P24.

Biểu đồ đĩa

Thiết lập phân tích

Thiết lập phân tích Transcreener trên máy đọc đĩa vi tấm SpectraMax iD5 được thể hiện trong Bảng 1.

SpectraMax iD5 được vận hành bằng Phần mềm SoftMax® Pro. Bắt đầu bằng giao thức được cấu hình sẵn từ thư viện giao thức và sửa đổi như mô tả. Đảm bảo bộ lọc FP chính xác được cài đặt trước khi tiếp tục.

  1. Mở Phần mềm SoftMax Pro và nhấp vào ‘Protocol Manager’, sau đó nhấp vào ‘Protocol Library’ để truy cập các giao thức được cấu hình sẵn. Trong thư mục ‘SpectraMax iD5 MultiMode Microplate Reader Protocols’, chọn giao thức ‘FP Rhodamine’.
  2. Nhấp vào ‘Plate1’ trong Cây điều hướng và nhấp vào Cài đặt (biểu tượng bánh răng) để mở hộp thoại Cài đặt.
  3. Chế độ đọc ‘FP’ và Loại đọc ‘Điểm cuối’ phải được đánh dấu.
  4. Cài đặt bước sóng được xác định bởi các bộ lọc được chèn vào và người dùng không thể thay đổi
  5. Nhấp vào ‘Plate Type’ và chọn Định dạng tấm ‘384 Wells’ và chọn ‘384 Well Corning low vol/rndbtm’ cụ thể.
  6. Nhấp vào ‘Read Area’ và chọn các giếng để đọc trên sơ đồ tấm.
  7. Nhấp vào ‘PMT and Optics’. Chọn ‘Off – Stop and Go’ hoặc ‘Performance – On the fly’.
  8. Nếu chọn Stop and Go, hãy nhập thời gian tích hợp là 30 ms hoặc cao hơn. Thời gian tích hợp dài hơn thường mang lại hiệu suất tốt hơn, nhưng việc đọc đĩa sẽ mất nhiều thời gian hơn.
  9. Nếu biết chiều cao đọc tối ưu, hãy nhập chiều cao đó. Đối với bất kỳ xét nghiệm hoặc loại đĩa mới nào, cần thực hiện tối ưu hóa chiều cao đọc. Nếu thực hiện tối ưu hóa, hãy để chiều cao đọc ở giá trị mặc định 1 mm. Sau khi thực hiện tối ưu hóa, chiều cao đọc mới (tối ưu) sẽ thay thế giá trị mặc định.
  10. Nhấp vào ‘More Settings’. Chọn thứ tự đọc, ‘Row’ nếu toàn bộ đĩa hoặc một vài hàng hoàn chỉnh sẽ được đọc hoặc ‘Column’ nếu chỉ một vài cột hoàn chỉnh sẽ được đọc.
  11. Đánh dấu vào ô bên cạnh ‘Show Pre-Read Optimization Options’.
  12. Nhấp vào ‘OK’ để đóng hộp thoại Cài đặt
  13. Nhấp vào Đọc. Trình hướng dẫn hiển thị các tùy chọn tối ưu hóa sẽ xuất hiện. Thực hiện cả tối ưu hóa vi đĩa và tối ưu hóa chiều cao đọc cho bất kỳ xét nghiệm hoặc lô đĩa mới nào.
Tham số Cài đặt
Bộ lọc FP kép Phân cực huỳnh quang
Bộ lọc: Bước sóng/băng thông Kích thích: FP H 624/40; FP V 624/40 Phát xạ: FP H 684/24; FP V 684/24
Loại đọc Điểm cuối
PMT và Quang học PMT trung bình, thời gian tích hợp 100 ms
Đọc chiều cao 6,61 mm cho đĩa Corning 3676; tối ưu hóa cho các đĩa khác

Bảng 1. Thiết lập máy đọc đĩa vi tấm SpectraMax iD5 được khuyến nghị. Tối ưu hóa trước khi đọc vi mạch và chiều cao đọc nên được thực hiện cho mỗi loại vi tấm mới được sử dụng.

Kết quả

Đường cong chuẩn FP mẫu

Khi tỷ lệ ADP so với ATP tăng, tỷ lệ chất đánh dấu liên kết so với chất đánh dấu tự do giảm, dẫn đến giá trị mP giảm tổng thể. Các đĩa thử nghiệm chứa đường cong chuẩn 15 điểm được đọc trên SpectraMax iD5.

Biểu đồ kết quả xét nghiệm so với các tham số xác thực xét nghiệm được hiển thị trong Hình 2. Bảng 2 tóm tắt các kết quả thu được với các thời gian tích hợp khác nhau; yêu cầu về hiệu suất xét nghiệm được vượt quá khi sử dụng thời gian tích hợp là 150 ms.

Hình 2. Các tham số xác nhận xét nghiệm. A: Các giá trị Z’ và Δ mP được quan sát thấy trong đường cong chuẩn mô phỏng quá trình chuyển đổi 10 μM ATP thành ADP. B: Chế độ xem phóng to của phần ADP 0-2 μM của đường chuẩn cho thấy dữ liệu xác nhận tối thiểu xác nhận Z’ (đường nét đứt màu đỏ) và dữ liệu xác nhận tối thiểu xác nhận Δ mP (đường nét đứt màu đen). Điểm xác nhận chuyển đổi ATP 10% cũng được chỉ ra (đường nét đứt màu đen dọc).
Thời gian tích hợp 20 giây 30 giây 50 giây 100 mili giây 150 giây 200 mili giây 300 mili giây
Thời gian đọc (phút, 384 giếng) 01:56 02:05 02:20 02:58 03:36 04:14 05:33
∆ mP ở mức chuyển đổi 0% ATP 117,2 125 124,1 122,2 124,3 125,1 125,4
Hệ số Z’ ở mức chuyển đổi ATP 10% 0,54 0,62 0,67 0,66 0,71 0,71 0,74

Bảng 2. Hiệu suất thử nghiệm với nhiều cài đặt thiết bị khác nhau. Yêu cầu xác thực được đáp ứng bằng cách sử dụng thời gian tích hợp là 150 ms.

Kết luận

Giao thức ứng dụng này chứng minh việc xác thực máy đọc đĩa vi tấm SpectraMax iD5 để sử dụng với Transcreener FP Assays. Bằng cách sử dụng các thiết lập thiết bị được tối ưu hóa được đề xuất tại đây, giá trị Z’ > 0,7 và Δ mP > 120 có thể đạt được với thời gian đọc dưới 4 phút. Có thể đạt được kết quả vượt quá yêu cầu xác thực tối thiểu bằng cách sử dụng thời gian tích hợp dài hơn.

Nguồn: https://www.moleculardevices.com/en/assets/app-note/br/optimizing-performance-of-transcreener-fluorescence-polarization-assays-with-spectramax-id5-multi-mode-microplate-reader

Minh Khang là nhà phân phối và nhập khẩu trực tiếp các Máy đọc đĩa vi tấm hãng Molecular Devices.