Máy đọc đĩa SpectraMax iD3: Đánh giá sức khỏe tế bào qua các phân tích khả năng sống

Giới thiệu: Đánh giá sức khỏe tế bào qua các phân tích khả năng sống

Việc đo lường sức khỏe tế bào từ nhiều góc nhìn về khả năng sống và con đường apoptosis có thể cung cấp cái nhìn sâu sắc về tác động của nhiều phương pháp thử nghiệm khác nhau, bao gồm các thuốc điều trị, chất kích hoạt và chất ức chế tín hiệu, và gen báo hiệu

Một trong những phương pháp phổ biến nhất để đánh giá sức khỏe tế bào là phát hiện huỳnh quang bằng máy đọc đĩa vi tấm. Trong ghi chú ứng dụng này, Molecular Devices báo cáo việc sử dụng bộ kit EarlyTox™ Cell Viability trên Máy đọc đĩa vi tấm đa năng SpectraMax iD3 (Hình 1).

Hình 1. Quy trình thực nghiệm tiêu biểu cho xét nghiệm khả năng sống của tế bào.

Bộ xét nghiệm EarlyTox Live/Dead

Bộ dụng cụ chứa hai chất đánh dấu cho tế bào sống hoặc chết phù hợp để sử dụng với tế bào động vật có vú. Calcein AM là chất đánh dấu tế bào sống được sử dụng rộng rãi. Calcein AM không huỳnh quang thấm qua màng tế bào nguyên vẹn và được chuyển đổi thành calcein huỳnh quang bởi các esterase nội bào. Tế bào sống được nhuộm bằng huỳnh quang màu xanh lá cây mạnh trong tế bào chất. Đối với các xét nghiệm tăng sinh tế bào hoặc các xét nghiệm khác chỉ cần nhuộm tế bào sống, calcein AM có thể được sử dụng như một thuốc thử độc lập như được cung cấp trong Bộ xét nghiệm tế bào sống EarlyTox™

Ethidium homodimer-III (EthD-III) hầu như không phát huỳnh quang và không thấm qua màng tế bào nguyên vẹn. Trong trường hợp tính toàn vẹn của màng tế bào bị tổn hại liên quan đến chết tế bào, EthD-III sẽ xâm nhập vào tế bào và liên kết với axit nucleic, dẫn đến huỳnh quang màu đỏ tươi trong tế bào chết. Các sự kiện gây độc tế bào ảnh hưởng đến tính toàn vẹn của màng tế bào có thể được đánh giá chính xác bằng phương pháp này.

Tín hiệu huỳnh quang từ calcein và EthDIII có thể được phát hiện bằng đầu đọc SpectraMax iD3 và được phân tích nhanh chóng bằng giao thức EarlyTox Live Dead được cấu hình sẵn trong Phần mềm SoftMax® Pro.

Bộ xét nghiệm EarlyTox Glutathione

Bộ dụng cụ này sử dụng monochlorobimane (MCB), một loại thuốc nhuộm thấm tế bào có ái lực cao với GSH, để phát hiện nồng độ GSH trong tế bào. Phản ứng của thuốc nhuộm với GSH được xúc tác bởi các enzyme glutathioneS-transferase (GST) nội sinh và tạo ra huỳnh quang màu xanh lam với sự kích thích ở 394 nm và phát xạ ở 490 nm. Cường độ huỳnh quang tương ứng với lượng GSH có trong tế bào, tăng lên theo quá trình apoptosis. Không giống như các xét nghiệm của đối thủ cạnh tranh tiêu biểu, xét nghiệm EarlyTox Glutathione có thể được sử dụng trên các tế bào sống, nguyên vẹn ở định dạng vi đĩa mà không cần thu hoạch tế bào và ly tâm, ly giải hoặc các thao tác tốn thời gian khác có thể dẫn đến sự thay đổi trong kết quả. Cài đặt thiết bị và phân tích trong Phần mềm SoftMax Pro được đơn giản hóa với giao thức EarlyTox Glutathione được cấu hình sẵn.

Bộ xét nghiệm EarlyTox Caspase-3/7 R110

Bộ xét nghiệm EarlyTox Caspase-3/7 R110 cung cấp xét nghiệm đồng nhất, một bước được thiết kế riêng cho người đọc vi mạch. Chất nền huỳnh quang (Ac-DEVD) ₂ -R110 chứa hai trình tự mục tiêu đồng thuận DEVD và được thủy phân hoàn toàn trong dịch phân hủy tế bào bởi các enzyme trong hai bước liên tiếp. Thủy phân cả hai peptide DEVD giải phóng thuốc nhuộm huỳnh quang màu xanh lá cây rhodamine 110 (R110), dẫn đến sự gia tăng huỳnh quang đáng kể, với sự kích thích ở 490 nm và phát xạ ở 520 nm. Quy trình làm việc được đơn giản hóa giúp giảm số lượng tế bào thường cần thiết cho xét nghiệm như vậy và cũng như sự thay đổi thường gặp với nhiều bước. Một giao thức thu thập và phân tích EarlyTox R110 được cấu hình sẵn có trong thư viện giao thức SoftMax Pro.

Nguyên vật liệu

• Bộ xét nghiệm EarlyTox™ Live/Dead
  • Bộ Explorer (kích thước 2 tấm, Thiết bị phân tử P/N R8340)
  • Bộ sản phẩm số lượng lớn (kích thước 10 tấm, Thiết bị phân tử P/N R8341)
• Bộ xét nghiệm EarlyTox™ Glutathione
  • Bộ Explorer (kích thước 2 tấm, Thiết bị phân tử P/N R8344)
  • Bộ sản phẩm số lượng lớn (kích thước 10 đĩa, Thiết bị phân tử P/N R8345)
• Bộ xét nghiệm EarlyTox™ Caspase-3/7 R110
  • Bộ Explorer (kích thước 2 đĩa, Thiết bị phân tử P/N R8346)
  • Bộ sản phẩm số lượng lớn (kích thước 10 đĩa, Thiết bị phân tử P/N R8347)
• Tế bào HeLa (ATCC P/N CCL-2)
• Staurosporin (Sigma P/N S5921)
• Đĩa vi tấm 96 giếng màu đen, đáy trong suốt (Corning P/N 3904)
• Máy đọc đĩa vi tấm đa năng SpectraMax iD3

Phương pháp

Xử lý tế bào

Tế bào HeLa được nuôi cấy ở mức 20.000 tế bào trên mỗi giếng trong 100 µL trên mỗi giếng trong một microplate đen, đáy trong suốt. Chúng được phép bám vào và phát triển qua đêm trong tủ ấm 37°C, 5% CO2 _. Sau đó, các tế bào được xử lý để gây apoptosis. Đối với xét nghiệm Sống/Chết, chúng được xử lý trong 24 giờ bằng dung dịch pha loãng staurosporine theo tỷ lệ 1:2 từ 10 µM xuống 40 nM. Đối với xét nghiệm Glutathione và Caspase-3/7 R110, chúng được xử lý trong bốn giờ bằng dung dịch pha loãng staurosporine theo tỷ lệ 1:2 từ 5 µM xuống 5 nM. Bốn bản sao được chạy ở mỗi nồng độ.

Bộ xét nghiệm EarlyTox Live/Dead

Dung dịch làm việc 2X của calcein AM/EthD-III được chuẩn bị bằng cách thêm dung dịch gốc calcein AM và EthD-III vào PBS để có nồng độ 6 µM cho mỗi thuốc nhuộm. 100 µL dung dịch làm việc 2X được thêm vào mỗi giếng xét nghiệm, tạo ra thể tích cuối cùng là 200 µL và nồng độ cuối cùng là 3 µM cho mỗi thuốc nhuộm. Đĩa được ủ ở nhiệt độ phòng trong một giờ. Sau đó, đĩa được đọc từ trên xuống dưới trên máy đọc SpectraMax iD3 bằng giao thức được cấu hình sẵn trong Phần mềm SoftMax Pro với các cài đặt được chỉ ra trong Bảng 1. Lưu ý: việc loại bỏ môi trường, sau đó thêm dung dịch 1X của calcein AM và EthD-III là tùy chọn và có thể giúp giảm huỳnh quang nền nếu cần.

Giao thức xét nghiệm EarlyTox Live Dead được cấu hình sẵn trong Phần mềm SoftMax Pro tự động tính toán tỷ lệ xanh/đỏ, sau đó được biểu diễn theo nồng độ hợp chất. Giao thức cho phép tính toán phần trăm tế bào sống và chết trong các mẫu tế bào thử nghiệm khi cần phân tích như vậy. Đối với các phép tính này, cần thiết lập các điều khiển bổ sung trong đĩa xét nghiệm.

Bộ xét nghiệm EarlyTox Glutathione

Dung dịch làm việc MCB 20 µM được chuẩn bị bằng cách pha loãng 20 µL dung dịch gốc MCB 10 mM trong 10 mL PBS. Môi trường được loại bỏ khỏi các tế bào trong đĩa thử nghiệm và thay thế bằng 100 µL dung dịch làm việc MCB. Các tế bào được ủ ở 37°C. Sau một giờ và hai giờ sau khi thêm thuốc thử, cường độ huỳnh quang được đo trên máy đọc đĩa SpectraMax iD3 bằng cách sử dụng các cài đặt được chỉ ra trong Bảng 1.

Bảng 1. Cài đặt cho SpectraMax iD3. Cài đặt tương tự sẽ hoạt động cho các máy đọc đĩa SpectraMax khác có chức năng phát hiện huỳnh quang.

Bộ xét nghiệm EarlyTox Caspase-3/7 R110

Chất đệm phân tích chất nền được chuẩn bị bằng cách thêm chất nền enzyme (AC-DEVD) ₂ -R110 (2 mM) vào chất đệm phân tích/ly giải tế bào theo tỷ lệ 50 µL với 1 mL đệm. 100 µL chất đệm phân tích chất nền được thêm vào mỗi giếng, tạo ra thể tích cuối cùng là 200 µL cho mỗi giếng và nồng độ cuối cùng là 50 µM chất nền. Sau đó, các mẫu được ủ ở nhiệt độ phòng. Huỳnh quang được đo trên SpectraMax iD3 sau một giờ và hai giờ sau khi thêm thuốc thử bằng cách sử dụng các cài đặt được chỉ ra trong Bảng 1.

Kết quả

Bộ xét nghiệm EarlyTox Live/Dead

Tế bào HeLa được xử lý bằng staurosporine cho thấy phản ứng nồng độ rõ ràng, dễ dàng định lượng được là tỷ lệ tín hiệu sống (huỳnh quang xanh) so với tín hiệu chết (huỳnh quang đỏ) (Hình 2). Nhìn chung, giá trị RFU cao hơn đối với tế bào được ủ trong hai giờ so với tế bào được ủ trong một giờ (dữ liệu không được hiển thị). Giá trị EC ₅₀ được tính toán từ đường phù hợp 4 tham số của dữ liệu là 300 nM.

Hình 2. Xét nghiệm EarlyTox Live/Dead: đường phản ứng nồng độ đối với tế bào HeLa được xử lý bằng staurosporine trong 24 giờ. Các tế bào được ủ trong calcein AM và EthD-III trong một giờ. Đường nồng độ được vẽ bằng cách sử dụng tỷ lệ RFU màu xanh lá cây (phát xạ 530 nm) trên màu đỏ (phát xạ 645 nm) tại trục Y. Đường cong phù hợp 4 tham số được áp dụng trong Phần mềm SoftMax Pro. Giá trị EC ₅₀ là 300 nM.

Bộ xét nghiệm EarlyTox Glutathione

Các tế bào HeLa được xử lý bằng staurosporine trong bốn giờ biểu hiện sự giảm liên quan đến apoptosis trong glutathione nội bào được đo bằng xét nghiệm EarlyTox Glutathione. Sự giảm huỳnh quang khi nồng độ staurosporine tăng đã được phát hiện SpectraMax iD3. Kết quả được biểu diễn bằng đồ thị trong Phần mềm SoftMax Pro bằng cách sử dụng biểu đồ đường phù hợp 4 tham số. Các giá trị cường độ huỳnh quang tăng theo thời gian, nhưng các giá trị EC ₅₀ tương tự là 263 nM và 295 nM đã thu được cho thời gian ủ xét nghiệm trong khoảng từ một đến hai giờ (Hình 3).

Hình 3. Xét nghiệm EarlyTox Glutathione: đường phản ứng nồng độ đối với tế bào HeLa được xử lý bằng staurosporine trong bốn giờ. Các tế bào được ủ trong thuốc thử trong một (biểu đồ màu xanh lá cây) hoặc hai (biểu đồ màu xanh lam) giờ. Đường nồng độ được vẽ bằng cách sử dụng đường biểu diễn phù hợp 4 tham số trong Phần mềm SoftMax Pro. Giá trị EC₅₀ lần lượt là 263 nM và 295 nM.

Bộ xét nghiệm EarlyTox Caspase-3/7 R110

Tế bào HeLa được xử lý bằng staurosporine trong bốn giờ đã biểu hiện phản ứng apoptosis được đo bằng xét nghiệm EarlyTox Caspase-3/7 R110. Huỳnh quang tương ứng với các tế bào apoptosis được phát hiện bằng SpectraMax iD3. Kết quả được biểu diễn bằng đồ thị trong Phần mềm SoftMax Pro bằng cách sử dụng đường phù hợp 4 tham số. Các tế bào được ủ trong chất nền trong một hoặc hai giờ có giá trị EC₅₀ tương tự là 193 nM và 200 nM (Hình 4).

Hình 4. Xét nghiệm EarlyTox Caspase-3/7 R110: đường phản ứng nồng độ đối với tế bào HeLa được xử lý bằng staurosporine trong bốn giờ. Các tế bào được ủ trong thuốc thử trong một (biểu đồ màu đỏ) hoặc hai (biểu đồ màu xanh) giờ. Đường nồng độ được vẽ bằng cách sử dụng đường phù hợp 4 tham số trong Phần mềm SoftMax Pro. Giá trị EC₅₀ lần lượt là 193 nM và 200 nM.

Kết luận

Được sử dụng cùng với máy đọc đĩa SpectraMax iD3, Bộ xét nghiệm khả năng sống của tế bào EarlyTox cho phép đo trực tiếp các tế bào sống và chết hoặc tế bào chết theo chương trình với quy trình làm việc đơn giản và thông lượng tăng lên do định dạng vi đĩa cung cấp. Kết quả nhất quán thu được theo thời gian, mang lại sự linh hoạt cho quy trình làm việc. Các giao thức Phần mềm SoftMax Pro được cấu hình sẵn cung cấp các cài đặt thiết bị được tối ưu hóa và tăng tốc thời gian để có kết quả với phân tích dữ liệu tự động.

Máy đọc đĩa vi tấm đa năng SpectraMax iD3

Máy đọc SpectraMax iD3 có giao diện màn hình cảm ứng lớn, độ phân giải cao với gói phần mềm nhúng cho phép người dùng thiết lập các giao thức tùy chỉnh, sử dụng các giao thức được tải sẵn và chạy thử nghiệm mà không cần hệ thống máy tính chuyên dụng. Chức năng giao tiếp trường gần (NFC) tích hợp cho phép truy cập vào các giao thức và kết quả tùy chỉnh chỉ bằng một lần chạm, giúp tiết kiệm thời gian quý báu.

Nguồn: https://www.moleculardevices.com/en/assets/app-note/br/measuring-cell-health-on-the-spectramax-id3-reader-with-cell-viability-assays