Tóm tắt
Trước đây, Molecular Devices đã trình bày một phương pháp tách tế bào đơn nhanh chóng và hiệu quả sử dụng tế bào CHO và HEK, đồng thời vẫn đảm bảo tính toàn vẹn của tế bào và cung cấp bằng chứng về tính đơn dòng của chúng. Tuy nhiên, so với tế bào CHO và HEK, việc thu được các dòng khuẩn lạc từ tế bào gốc vạn năng cảm ứng trong cơ thể (hiPSCs) gặp nhiều khó khăn hơn. Trong ghi chú ứng dụng này, hãng đã trình bày việc sử dụng hệ thống phân phối tế bào đơn dựa trên trở kháng kết hợp với hệ thống sàng lọc hình ảnh huỳnh quang tự động hiệu suất cao để thu được các dòng tế bào đơn dòng từ tế bào gốc vạn năng trong cơ thể thông qua quy trình chọn lọc tế bào đơn bền vững.
Phương pháp
Quy trình làm việc (Hình 1, bước 3 và 4) để phân phối tế bào đơn, đặc tính của các khuẩn lạc và đánh giá tính đơn dòng bao gồm thiết bị phân phối tế bào đơn (DispenCell™ Single-Cell Dispenser) và hệ thống chụp ảnh tế bào tự động (CloneSelect® Imager FL). Với bộ thiết bị này, các tế bào iPSC được phân phối vào các đĩa 96 và 384 giếng, sau đó được chụp ảnh ngay trong Ngày 0 để đảm bảo tính đơn dòng kép (dựa trên trở kháng và hiển vi), và tiếp tục được theo dõi định kỳ quá trình phát triển bằng CloneSelect Imager FL (CSI FL). Phần mềm phân tích của DispenCell có khả năng nhận diện tế bào đơn và cung cấp các thông số tối ưu hóa như thời gian giữa hai sự kiện và thời gian trên mỗi đĩa để nâng cao hiệu suất phân phối tế bào đơn. Các tế bào được phân lập và chụp ảnh theo các bước như sau.
- Hình 1. Quy trình phát triển dòng tế bào sử dụng DispenCell™ và CloneSelect® Imager FL (CSI-FL).
Nuôi cấy tế bào
Tế bào iPSC người (ATCC ACS-1023™) được nuôi cấy trong đĩa 6 giếng phủ lớp nền Vitronectin XF ECM (Stemcell 07180) với môi trường mTeSR Plus, bao gồm Basal Media (Stemcell 100-274) được bổ sung với dung dịch bổ trợ mTeSR Plus 5X (Stemcell 100-275). Các tế bào được chuyền mỗi 3 hoặc 4 ngày bằng dung dịch tách tế bào ReLeSR (Stemcell 05872).
Thiết lập thử nghiệm
Trước khi chuẩn bị mẫu tế bào, Molecular Devices chuẩn bị môi trường mTeSR Plus có bổ sung chất ức chế ROCK Thiazovivin (Selleckchem S1459). Sau đó, 200 μL môi trường này được thêm vào mỗi giếng của đĩa 96 giếng và 50 μL vào mỗi giếng của đĩa 384 giếng. Các đĩa được ủ ở 37°C với 5% CO₂ cho đến khi sử dụng. Thiết bị được lắp đặt trong tủ cấy vô trùng và kết nối với máy tính theo hướng dẫn của nhà sản xuất.
Chuẩn bị mẫu tế bào
Các đĩa 6 giếng chứa tế bào gốc vạn năng trong cơ thể được xử lý bằng Accutase trong 5 phút ở 37°C trong tủ ấm. Sau đó, tế bào được pha loãng bằng môi trường nuôi cấy và lọc qua lưới lọc tế bào 20 μm (SEED Biosciences). Việc đếm tế bào được thực hiện bằng hệ thống đếm tự động Countess và buồng đếm tế bào máu để xác định chính xác nồng độ tế bào (tế bào/mL) và khả năng sống của chúng. Mức khả năng sống mong muốn là trên 90% và tế bào cần ở trạng thái huyền phù đơn bào. Nồng độ tế bào được điều chỉnh ở mức 200.000 tế bào/mL; nếu nồng độ vượt quá 200.000 tế bào/mL sẽ khiến khoảng thời gian giữa các tế bào khi phân phối giảm xuống dưới 3 giây, làm tăng nguy cơ có nhiều hơn một tế bào rơi vào cùng một giếng. Ngược lại, nếu nồng độ thấp hơn 200.000 tế bào/mL sẽ kéo dài tổng thời gian phân phối và do đó làm chậm toàn bộ quy trình, có thể ảnh hưởng tiêu cực đến khả năng sống của các tế bào iPSC.
Trộn với dung dịch đệm DispenMe
Dung dịch đệm DispenMe được cung cấp kèm theo bộ kit và cần được bảo quản ở 4°C trước khi sử dụng. Trộn nhẹ nhàng 15 μL huyền phù tế bào đơn đã chuẩn bị ở bước trước với 135 μL dung dịch đệm DispenMe bằng cách hút lên xuống bằng đầu pipet, không để xảy ra bất kỳ sự chậm trễ nào (nhằm tránh hiện tượng tế bào kết cụm). Cần tránh tạo bọt trong quá trình trộn.
Hệ thống phân phối tế bào đơn DispenCell
Thực hiện theo các bước trong hướng dẫn sử dụng DispenCell để nạp mẫu, cài đặt đĩa và thiết lập thiết bị trước khi phân phối (Hình 2).
Ngưỡng kích thước tế bào là 200 Ohm đã được chọn (dựa trên biểu đồ kích thước hạt được tạo ra trong quá trình tải mẫu).
Khoảng thời gian giữa các tế bào (Tcc) được khuyến nghị: ~ 2–5 giây
Thời gian xử lý (phân phối đĩa) Tcc Hiệu quả xử lý
Hệ thống ghi nhận hình ảnh CSI-FL
Các đĩa đã phân phối được chuyển cẩn thận đến máy ủ và chụp ảnh sau đó bằng CSI FL vào Ngày 0 để có hình ảnh Ngày 0, vào Ngày 3 và Ngày 7 để có hình ảnh phát triển của khuẩn lạc và cuối cùng vào Ngày 10 để có số lượng khuẩn lạc. Hình ảnh Ngày 0 được sử dụng để xác minh tính đơn dòng bằng tính năng báo cáo tính đơn dòng của CSI FL.
Kết quả
Molecular Devices đã chứng minh tính khả thi của quy trình làm việc sử dụng bộ thiết bị DispenCell và CSI FL để phân phối tế bào iPSC vào đĩa 96 giếng. DispenCell được trang bị công nghệ độc đáo cho phép xử lý mẫu tế bào một cách cực kỳ nhẹ nhàng — áp lực tác động lên tế bào không vượt quá mức của thao tác pipet thủ công (dưới 0,1 psi). Điều này giúp thiết bị duy trì được khả năng sống và phát triển của tế bào, đồng thời nâng cao hiệu suất phân phối tế bào. Ngoài ra, Molecular Devices đã xác nhận tính đơn dòng và theo dõi sự phát triển của khuẩn lạc thông qua dữ liệu hình ảnh từ hệ thống CSI FL.
- Hình 2. A. Hình ảnh lắp đặt đĩa 96 giếng trên giá đỡ máy phân phối B. Đĩa 1 được chọn với một đĩa 96 giếng làm ví dụ. C. Thời gian tải được khuyến nghị cho các loại đĩa khác nhau.
- Hình 3. Hình ảnh toàn bộ giếng vào Ngày 10 do CSI FL tạo ra, cho thấy các khuẩn lạc có màu xanh lá cây.
Đếm khuẩn lạc tự động
Tính năng Plate Thumbnails hiển thị toàn bộ đĩa và các giếng đã được chụp ảnh (Hình 3). Các hình thu nhỏ này bao gồm lớp phủ độ phủ tế bào (confluence overlay) của từng giếng đã chụp. Chúng tôi sử dụng màn hình này để lựa chọn các giếng được đưa vào hoặc loại ra khỏi quá trình phân tích, giúp tập trung vào những giếng có ý nghĩa nghiên cứu. Hình ảnh chụp vào Ngày thứ 10 được xử lý bằng tính năng Loci Count nhằm đếm số lượng và đo kích thước (diện tích) các khuẩn lạc trong từng giếng (Hình 4A). Chúng tôi điều chỉnh các ngưỡng trên và dưới của tiêu chí đánh giá để nhận diện khuẩn lạc một cách chính xác. Các tiêu chí bao gồm diện tích (kích thước của khuẩn lạc) và độ đặc (compactness – hình dạng của khuẩn lạc) (Hình 4B). Tính năng Loci Count của CSI FL tự động hiển thị số lượng khuẩn lạc trên mỗi giếng (Hình 5).
- Hình 4. A. Tính năng đếm Loci cho thấy diện tích của các khuẩn lạc trong mỗi giếng. B. Tính năng đếm Loci cho thấy độ đặc của khuẩn lạc.
- Hình 5. Tính năng Loci Count của CloneSelect Imager FL hiển thị số lượng khuẩn lạc trong mỗi giếng.
Sự phát triển và sàng lọc khuẩn lạc
Phần mềm CSI FL cho phép người dùng nhanh chóng chuyển đổi qua lại giữa các hình ảnh chụp tại các thời điểm khác nhau (Hình 6). Chúng tôi xác định các khuẩn lạc dựa trên hình ảnh Ngày thứ 10 và kiểm tra xem các khuẩn lạc đó có nguồn gốc từ một tế bào đơn (đơn dòng) hay nhiều tế bào (đa dòng) bằng cách đối chiếu với hình ảnh Ngày 0. Hình 6 minh họa ví dụ từ bốn giếng, cho thấy các khuẩn lạc được hình thành từ một tế bào duy nhất hoặc từ nhiều tế bào khác nhau.
Báo cáo đơn dòng
Tính năng Báo cáo đơn dòng của CSI FL cung cấp bằng chứng hình ảnh về đơn dòng trong quá trình phát triển dòng tế bào. Chỉ vài thao tác đơn giản, tính năng Báo cáo đơn dòng trên CSI FL sẽ sắp xếp khách quan bằng chứng hình ảnh hỗ trợ cần thiết để thiết lập tính đơn dòng thành một báo cáo dễ chia sẻ, giúp các nhà nghiên cứu tiết kiệm thời gian khi so sánh với các quy trình thủ công.
- Hình 6. Phần mềm CloneSelect Imager FL cho phép chuyển đổi giữa các hình ảnh tại các thời điểm khác nhau. Đây là ví dụ về cách công cụ này giúp phân biệt và đảm bảo (Đảm bảo Ngày 0) sự hiện diện của một tế bào so với nhiều tế bào hoặc mảnh vụn vào Ngày 0.
Kết luận và xu hướng
- Sự kết hợp giữa hệ thống phân phối tế bào đơn DispenCell và CloneSelect Imager FL mang đến một quy trình làm việc sáng tạo và đơn giản, dựa trên trở kháng để tách tế bào đơn còn nguyên vẹn và chụp ảnh phân tích.
- DispenCell cho hiệu suất phân phối cao và khả năng sống tế bào iPSC vượt trội.
- DispenCell và CSI/CSI FL có thể tích hợp vào một quy trình tự động hóa toàn diện với sự hỗ trợ của robot cộng tác, thiết bị ủ tự động và hệ thống xử lý chất lỏng tự động.
- Việc tích hợp này không chỉ giúp tăng thông lượng và độ tin cậy của quá trình phân phối tế bào, mà còn mở ra tiềm năng hỗ trợ các ứng dụng như chỉnh sửa gen một cách hiệu quả hơn.
Minh Khang là nhà nhập khẩu và phân phối trực tiếp Máy phân phối tế bào đơn hãng Molecular Devices
EN