Synthetic metagenomics (giải trình tự metagenomics tổng hợp) giúp đồng thời phát hiện các khuẩn lạc và định lượng các dấu hiệu huỳnh quang—sử dụng lựa chọn kiểu hình để chọn các khuẩn lạc; tự động hóa quy trình nuôi cấy và trải mẫu đến chọn mẫu; ghi lại và theo dõi lịch sử mẫu từ việc trải mẫu, chọn lọc, sao chép và sắp xếp lại; thu thập chính xác tới 30.000 khuẩn lạc được chọn mỗi ngày với hiệu suất > 98%.
Các nhà nghiên cứu tại Viện nghiên cứu DoE JGI đã phát triển các quy trình metagenomics tổng hợp được hỗ trợ bởi các công nghệ sàng lọc thông lượng cao, để chuyển đổi lượng lớn dữ liệu “kỹ thuật số” được tạo ra bởi giải trình tự thế hệ mới thành dữ liệu sinh học hữu hình có thể quan sát được.
Giới thiệu nguyên lý giải trình tự metagenomics tổng hợp
Các công nghệ giải trình tự thế hệ mới đã dẫn đến việc xác định hàng triệu gen dự đoán bao gồm toàn bộ quang phổ các chuỗi sinh hóa và các hoạt động chức năng đã biết. Chúng bao gồm một số lượng lớn các chất xúc tác sinh học mới cho các ứng dụng tiềm năng trong công nghệ năng lượng và môi trường, và các ứng dụng tiềm năng trong nghiên cứu cơ bản và công nghệ sinh học ứng dụng. Một thách thức lớn là chuyển đổi lượng lớn thông tin “kỹ thuật số” (giải trình tự, tin sinh học, tin hóa học) thành sinh học chức năng có thể quan sát được (hoạt động của enzyme, chết tế bào, biểu hiện protein, v.v.).
JGI DoE đã phát triển một quy trình quy trình metagenomics để vượt qua thách thức này. Các gen và chuỗi sinh hóa được tổng hợp theo cách độc lập với khuôn mẫu, do đó chuyển đổi thông tin kỹ thuật số thành các phân tử sinh hóa theo cách nhanh chóng và tiết kiệm chi phí.
Một nút thắt lớn đối với sản xuất thương mại nhiên liệu sinh học xenlulo là thiếu các enzyme đủ hoạt động và mạnh mẽ để chuyển đổi sinh khối thành glucose. Chất lỏng ion có thể được sử dụng như một phương pháp xử lý trước để hòa tan xenlulo, giúp tăng khả năng sử dụng các loại đường có thể lên men như glucose. Để tìm ra các ứng cử viên enzyme phù hợp, có liên quan đến công nghiệp, các phương pháp tiếp cận metagenomic tổng hợp đã được sử dụng. Đối với một ứng dụng công nghiệp cụ thể được thiết kế tại Viện Năng lượng sinh học của DoE (JBEI), các enzyme bắt buộc đáp ứng các tiêu chí sau: (i) hoạt động enzyme chức năng ở 70°C, (ii) độ ổn định ở pH 4,5 và (iii) khả năng chống lại chất lỏng ion. Khi bắt đầu dự án, không có enzyme nào được biết đến thể hiện đủ hoạt động trong các điều kiện yêu cầu.
Hình 1: Quy trình metagenomics tổng hợp: một quy trình được DoE JGI điều chỉnh cho các nghiên cứu metagenomic. Sơ đồ tổng hợp điển hình cho các nghiên cứu metagenomic. Sử dụng Hệ thống QPix 460 trong các giai đoạn nhân bản và chọn lọc rút ngắn đáng kể thời gian làm việc và tăng hiệu quả bằng cách tự động hóa một nhiệm vụ thủ công tốn nhiều công sức và dễ xảy ra lỗi. Quy trình làm việc hoàn toàn tự động có thể xử lý chính xác hàng nghìn khuẩn lạc mỗi tuần, từ cấy đến chọn lọc, với việc theo dõi dữ liệu đầy đủ giúp giảm chi phí cho mỗi cặp bazơ.
Mục tiêu nghiên cứu đầu tiên liên quan đến một họ enzyme được gọi là GH1s, có chức năng trung gian chuyển đổi cellobiose thành glucose. Các phương pháp tiếp cận theo hướng phát sinh loài đã cho phép lựa chọn 200 gen nắm bắt được sự đa dạng chức năng tối đa từ hàng nghìn trình tự có sẵn. Trong số 200 gen, 180 gen đã được tổng hợp và nhân bản thành một vectơ biểu hiện bằng Hệ thống QPix 460 (Hình 2).
Hình 2. Phân tích phát sinh metagenomic để chọn ra các họ gen tiêu biểu. Sơ đồ cây của metagenome, bao gồm vi khuẩn (màu đỏ), sinh vật nhân chuẩn (màu xanh), dạ cỏ bò (màu tím) và cổ khuẩn/“sinh vật nhân sơ cực đoan” (màu xanh lá cây). Chiều dài nhánh dài cho thấy sự đa dạng di truyền gia tăng, trong khi chiều dài ngắn thì không. 200 mẫu tiêu biểu từ các vùng nhánh ngắn hơn đã được chọn, bao gồm 15 mẫu từ dạ cỏ bò để góp phần vào sự đa dạng mẫu do phát sinh loài thúc đẩy.
Quy trình làm việc tự động, thông lượng cao được phát triển tại DoE JGI bao gồm chuyển đổi song song, cấy và chọn nhiều bản sao từ mỗi biến thể gen để xác minh trình tự. Điều này có thể thực hiện được nhờ Hệ thống QPix 460, cung cấp đồng thời fkhả năng cấy, trải và chọn khuẩn lạc thông lượng cao. Sau khi trình tự được xác minh, các bản sao mong muốn cho mỗi gen được chuyển vào các chủng sản xuất protein.
Các dòng sản xuất protein GH1 được nhân bản đã được phân tích để biểu hiện protein hòa tan. 65% các dòng sản xuất protein hòa tan được đặc trưng thêm trong các điều kiện cần thiết được mô tả ở trên. Ví dụ, như một biện pháp kiểm soát chất lượng ban đầu, một số enzyme đã được đặc trưng về hoạt động ở các nhiệt độ khác nhau, cho thấy các ứng cử viên có đặc tính chịu nhiệt (Hình 3).
Hình 3. Đặc điểm hoạt động của enzyme họ GH1 cho thấy các enzyme chịu nhiệt. Hoạt động của enzyme chống lại các chất nền màu được đo bằng mật độ quang học. Protein được thử nghiệm hoạt động của enzyme ở bảy nhiệt độ khác nhau, từ 30°C đến 90°C. Các đối tượng tối ưu (ví dụ 22D) cho thấy hoạt động giảm ít hoặc không giảm ở 70°C.
Để sàng lọc ~15.000 phản ứng cần thiết để đánh giá tất cả các tiêu chí lựa chọn, cần có công nghệ thông lượng cực cao. Phổ khối khởi tạo cấu trúc nano (NIMS), một công nghệ thông lượng cao dựa trên phổ khối (1) đã được sử dụng cho mục đích này.
Phản ứng giữa enzyme và chất nền được chấm lên một chất rắn và ion hóa bằng tia laser.
Hoạt động của enzyme được xác định bằng cách định lượng tỷ lệ chất nền với sản phẩm (Hình 4). Từ tập dữ liệu lớn này, 20 enzyme hoạt động tốt nhất đã được chọn để mô tả chuyên sâu, trong đó có năm enzyme hoạt động trong các điều kiện liên quan đến công nghiệp được mô tả ở trên. Điều này chứng minh việc sử dụng metagenomics tổng hợp để nhanh chóng xác định các enzyme có đặc tính độc đáo bắt đầu từ các protein dự đoán trong cơ sở dữ liệu trình tự công khai.
Hình 4. Tỷ lệ chất nền: sản phẩm dựa trên NIMS. Phân tích NIMS cho thấy 20 enzyme hoạt động tốt nhất dựa trên phản ứng tối ưu với chất nền được đo bằng tỷ lệ chất nền/sản phẩm.
Kết luận
Dữ liệu này chứng minh quy trình do DoE JGI phát triển và sử dụng có thể chuyển đổi thành công thông tin kỹ thuật số thành các enzyme chức năng có liên quan đến sinh học, thể hiện các đặc tính mới. 180 protein đa dạng từ họ enzyme GH1 đã được sàng lọc theo phương pháp tự động, thông lượng cao sử dụng Hệ thống QPix 460. Hệ thống đã trở thành một phần không thể thiếu của quy trình làm việc tự động để tạo và quản lý thư viện metagenomic hiệu quả.
Hơn nữa, quá trình này dẫn đến việc xác định 5 enzyme mới có hoạt tính chống lại các chất nền có liên quan đến công nghiệp ở 70°C, pH 4,5 và khi có chất lỏng ion. Viện Năng lượng sinh học JBEI hiện đang nghiên cứu ứng dụng tiềm năng của các enzyme này trong bối cảnh công nghiệp để mở rộng quy mô sản xuất hiệu quả quá trình chuyển đổi sinh khối thành glucose.
Tài liệu tham khảo
- A nanostructure-initiator mass spectrometrybased enzyme activity assay. Northen TR, Lee JC, Hoang L, Raymond J, Hwang DR, Yannone SM, Wong CH, Siuzdak G. Proc Natl Acad Sci USA. 2008 Mar 11;105(10):3678-83. doi: 10.1073/pnas.0712332105. Epub 2008 Mar 4. PMID:18319341 [PubMed – indexed for MEDLINE]
Minh Khang là nhà phân phối và nhập khẩu trực tiếp các Thiết bị chọn lọc khuẩn lạc hãng Molecular Devices
EN