Đếm tế bào dòng chảy theo phổ: Nền tảng công nghệ và ứng dụng trong phân tích miễn dịch học tiên tiến

Tóm tắt nội dung

Đếm tế bào dòng chảy theo phổ là gì?

Đếm tế bào dòng chảy theo phổ là một kỹ thuật phân tích tiên tiến, cải tiến so với phương pháp đếm tế bào dòng chảy truyền thống bằng cách ghi nhận toàn bộ phổ phát xạ của các thuốc nhuộm huỳnh quang (fluorochrome). Khác với phương pháp truyền thống sử dụng gương lưỡng sắc và các bộ lọc chọn lọc bước sóng để đo các bước sóng cụ thể, phương pháp đếm tế bào dòng chảy theo phổ thu thập tín hiệu tại nhiều điểm trên toàn bộ phổ phát xạ của từng fluorochrome (Hình 1). Do đó, các hệ thống đếm tế bào theo phổ thường sử dụng nhiều đầu dò hơn số lượng fluorochrome, trái ngược với cách tiếp cận “mỗi fluorochrome một đầu dò” trong phương pháp truyền thống. Kết quả là, kỹ thuật này cho phép phân tích đồng thời nhiều thông số một cách chính xác, nâng cao tính linh hoạt và độ chính xác trong thiết kế thí nghiệm cũng như diễn giải dữ liệu.

Tại sao nên áp dụng kỹ thuật đếm tế bào dòng chảy theo phổ

Gia tăng nhu cầu xét nghiệm tế bào đa thông số

Độ phức tạp của hệ thống miễn dịch – Khả năng ghép kênh của kỹ thuật đếm tế bào dòng chảy theo phổ, nhờ vào khả năng phân biệt giữa nhiều chất huỳnh quang có phổ phát xạ chồng lấp, cho phép thực hiện các phân tích đa chiều cần thiết để mô tả một cách toàn diện hệ miễn dịch. Bằng cách phát hiện đồng thời nhiều kháng thể, kỹ thuật này tạo điều kiện cho việc hiểu chi tiết hơn về các phân nhóm tế bào miễn dịch, cùng với chức năng và mối tương tác của chúng. Ví dụ, các nghiên cứu như OMIP-102 đã sử dụng đến 50 màu khác nhau trong ống mẫu để định danh miễn dịch tế bào từ mẫu máu ngoại vi ở người.
Hiểu rõ hơn về bệnh lý – Kỹ thuật đếm tế bào dòng chảy theo phổ giúp xây dựng hồ sơ đa thông số về các biểu hiện bệnh lý một cách hiệu quả hơn. Ví dụ, trong lĩnh vực ung thư học, công nghệ này hỗ trợ làm rõ tính phức tạp của bệnh ung thư bằng cách cho phép phân tích đồng thời nhiều kháng thể trên tế bào khối u cũng như trong vi môi trường miễn dịch. Nhờ đó, người ta có thể phát hiện những hiểu biết sâu sắc hơn về tính không đồng nhất của khối u và các cơ chế né tránh miễn dịch, từ đó mở ra tiềm năng xác định các mục tiêu điều trị mới.

Hình 1. Minh họa về những điểm khác biệt chính giữa kỹ thuật đếm tế bào dòng chảy truyền thống và theo phổ: A) Sơ đồ quang học của hệ thống đếm tế bào dòng chảy truyền thống sử dụng các bộ lọc chọn lọc bước sóng, trong đó mỗi đầu dò chỉ thu nhận một phần phổ phát xạ huỳnh quang của từng fluorochrome. (B) Hệ thống đếm tế bào dòng chảy theo phổ sử dụng nhiều đầu dò để thu nhận toàn bộ phổ phát xạ huỳnh quang của tất cả các fluorochrome, với cơ chế kích thích bằng đa laser.

Loại bỏ tín hiệu tự huỳnh quang

Một trong những thách thức lớn của đếm tế bào dòng chảy là nhiễu tín hiệu do tự huỳnh quang từ các thành phần nội bào. Đếm tế bào dòng chảy theo phổ có thể xử lý tín hiệu tự huỳnh quang như một tín hiệu riêng biệt để khử bỏ, nhờ đó làm nổi bật các tín hiệu huỳnh quang yếu.

Phân biệt thuốc nhuộm có phổ phát xạ tương tự

Đếm tế bào dòng chảy theo phổ mang lại một lợi thế đáng kể nhờ khả năng phân biệt các fluorochrome có cực đại phát xạ tương tự nhau nhưng phổ phát xạ phụ khác biệt. Nhờ đó, có thể sử dụng nhiều loại fluorochrome hơn trong cùng một thí nghiệm. Khả năng này giúp tăng số lượng thông số có thể được phân tích đồng thời. Ví dụ, APC và Alexa Fluor 647 có bước sóng phát xạ cực đại gần như giống nhau, nhưng lại thể hiện sự khác biệt ở phổ phát xạ phụ. Đếm tế bào dòng chảy theo phổ tận dụng các đặc điểm phổ riêng biệt này, cho phép sử dụng cả hai thuốc nhuộm trong cùng một panel mà không gây nhiễu lẫn nhau, từ đó nâng cao độ chính xác và tính linh hoạt trong phân tích (Hình 2).

Hình 2. Minh họa sự khác biệt trong phổ phát xạ của hai thuốc nhuộm có vùng phát xạ chồng lắp cao ở vùng đỏ xa – APC và Alexa Fluor 647 (A) Phổ phát xạ của APC và Alexa Fluor 647 cho thấy mức độ chồng lắp rất lớn. (B) Dấu hiệu phổ của hai thuốc nhuộm này – APC (màu xanh) và Alexa Fluor 647 (màu đỏ) – thể hiện những đặc điểm riêng biệt và khác nhau, giúp người dùng có thể sử dụng cả hai trong cùng một thí nghiệm đếm tế bào dòng chảy theo phổ.

Hướng dẫn từng bước cách áp dụng Kỹ thuật đếm tế bào dòng chảy theo phổ

Hình 3. Các bước cần thiết để thực hiện thí nghiệm đếm tế bào dòng chảy theo phổ

Trong khi tuân theo các quy tắc chung về chuẩn bị mẫu, chạy và phân tích dữ liệu như phương pháp phân tích tế bào dòng chảy thông thường, phương pháp phân tích tế bào dòng chảy theo phổ đòi hỏi một số cân nhắc bổ sung.

Lập kế hoạch thực nghiệm và thiết kế panel: Các yếu tố cần cân nhắc và khác biệt so với kỹ thuật đo dòng chảy huỳnh quang truyền thống

Hiểu rõ thiết bị

Máy đếm tế bào dòng chảy truyền thống thường được trang bị tối đa 6–7 laser và 20–25 đầu dò, phù hợp với nhiều ứng dụng thông thường nhưng bị giới hạn trong việc phân tích các mẫu phức tạp có nhiều fluorochrome. Ngược lại, máy đếm tế bào dòng chảy thep phổ thu ánh sáng phát ra tại nhiều điểm trong phổ khả kiến đối với từng fluorochrome, cho phép thu nhận gần như toàn bộ phổ huỳnh quang của mỗi fluorochrome. Việc này tạo ra một đặc điểm phổ riêng biệt cho từng fluorochrome, hỗ trợ việc phân tích mẫu phức tạp một cách toàn diện và chi tiết hơn.

Ánh sáng từ các laser khác nhau chiếu vào tế bào mục tiêu, và ánh sáng phát ra được dẫn đến các module đầu dò khác nhau, sử dụng ống nhân quang (PMT) hoặc diode quang điện kiểu avalanche (APD), tùy theo nhà sản xuất thiết bị phổ. PMT có độ nhạy cao trên nhiều bước sóng, trong khi APD có hiệu suất lượng tử cao, đặc biệt trong vùng đỏ xa của phổ. Việc thiết lập thiết bị chính xác—bao gồm công suất laser và căn chỉnh, hiệu chuẩn đầu dò và hiệu chỉnh độ khuếch đại bằng hạt chuẩn huỳnh quang, kiểm tra độ nhạy và tuyến tính, kiểm tra hiệu suất hằng ngày và cài đặt thu nhận dữ liệu phù hợp—là điều quan trọng để đảm bảo kết quả chính xác. Hạt chuẩn gắn kháng thể, thường dùng trong đếm tế bào dòng chảy truyền thống, cũng được sử dụng tương tự trong đếm tế bào dòng chảy theo phổ để hiệu chuẩn.

Hiểu rõ mẫu thử

Việc thiết kế panel đòi hỏi sự hiểu biết sâu sắc về sinh học của mẫu và tối ưu hóa quy trình xét nghiệm một cách tỉ mỉ. Điều này bao gồm: chuẩn bị mẫu, chuẩn độ kháng thể, chặn kháng nguyên, lựa chọn mẫu đối chứng, xác nhận quy trình nhuộm và tối ưu hóa cài đặt thu nhận dữ liệu. Cũng giống như quy trình truyền thống, quy trình phổ bắt đầu bằng việc xác định các quần thể tế bào và kháng thể đặc hiệu cần phân tích. Việc xử lý mẫu để đạt được hỗn dịch đơn bào với tỷ lệ sống cao là rất quan trọng trong đếm tế bào dòng chảy. Loại mẫu, nồng độ tế bào và thể tích nhuộm cần được điều chỉnh tùy theo thiết bị sử dụng. Cần thiết lập nồng độ kháng thể tối ưu và sử dụng đầy đủ các mẫu đối chứng—như mẫu không nhuộm, nhuộm đơn và mẫu đối chứng FMO (Fluorescence Minus One)—để thiết lập ngưỡng nền và cổng lọc (gating) chính xác.

Các yếu tố cần cân nhắc trong thiết kế panel

Tùy vào câu hỏi nghiên cứu, người dùng có thể thiết kế panel với các fluorochrome phù hợp nhất cho thí nghiệm. Thiết kế panel trong đếm tế bào dòng chảy phổ đề cập đến việc lựa chọn tổ hợp fluorochrome thích hợp với thiết bị, có cân nhắc đến hiện tượng chồng phổ và nhu cầu giải phổ. Không giống đếm tế bào dòng chảy truyền thống, nơi việc giảm thiểu chồng phổ là ưu tiên hàng đầu, đếm tế bào dòng chảy theo phổ cho phép lựa chọn fluorochrome linh hoạt hơn nhờ khả năng giải phổ, do đó panel thường lớn hơn so với phương pháp truyền thống. Có thể sử dụng nhiều công cụ như FluoroFinder, FlowJo, FCS Express… để tối ưu hóa panel bằng cách phân tích tổ hợp kháng thể và fluorophore. Khi thiết kế panel, cần lưu ý:

Phổ phát xạ toàn phần của mỗi fluorochrome và khả năng chồng lấn. Đếm tế bào dòng chảy theo phổ có thể phân giải các tín hiệu chồng phổ gần nhau, tuy nhiên kết quả tốt nhất đạt được khi phổ huỳnh quang của các fluorochrome tách biệt rõ ràng. Việc lựa chọn fluorochrome cần dựa trên sự tương thích với thiết bị và phổ phát xạ toàn phần. Hãy tham khảo các hướng dẫn phổ (spectral reference guides) phù hợp với thiết bị đang dùng.
Mức độ biểu hiện của các marker trong panel. Các kháng thể biểu hiện mạnh nên được gắn với fluorochrome có độ sáng thấp (như FITC, Pacific Orange…) để tránh làm lu mờ các kháng thể khác và giảm lỗi lan truyền tín hiệu. Ngược lại, các kháng thể biểu hiện yếu nên được gắn với fluorochrome sáng hơn (như APC, PE, BV421…) để tăng khả năng phát hiện. Kháng thể phổ biến nên được gán cho kênh có nhiễu tràn thấp nhất, trong khi kháng thể đặc hiệu nên dùng kênh có nhiễu tràn cao nhất. Tránh dùng fluorochrome có phổ chồng lấn nhiều cho các kháng thể đồng biểu hiện trên cùng tế bào.
Chọn kháng thể đã được chứng minh hiệu quả, gắn với fluorochrome đã chọn, và đảm bảo mỗi kháng thể liên kết đặc hiệu với kháng nguyên mục tiêu.
Khi dùng thuốc nhuộm huỳnh quang kép, hãy ưu tiên loại mới nhất và bảo vệ khỏi ánh sáng hoặc các tác nhân hóa học gây suy giảm.
Stain Index (SI) – chỉ số nhuộm đo khả năng phân tách tín hiệu huỳnh quang khỏi nền – nên được cân nhắc trong thiết kế panel để tăng độ phân giải fluorochrome và giảm SE.
Cần thêm thuốc nhuộm khả năng sống/chết để loại bỏ tế bào chết, vốn ảnh hưởng đến chất lượng dữ liệu.
Bắt đầu bằng các panel đơn giản, sau đó tăng dần độ phức tạp bằng cách thêm fluorochrome có đặc điểm phổ riêng
Việc xác định chính xác các quần thể tế bào có tự huỳnh quang cao là rất quan trọng. Tế bào không nhuộm có thể chứa nhiều phân tử huỳnh quang tự nhiên tạo nên đặc điểm phổ riêng biệt, gây ra tự huỳnh quang không đồng nhất. Nếu không thể loại bỏ hoàn toàn tín hiệu tự huỳnh quang, nên gán các quần thể có tự huỳnh quang cao nhất cho một kênh riêng biệt.
Cuối cùng, người dùng phải chuẩn độ kháng thể để xác định nồng độ tối ưu trước khi tiến hành thí nghiệm trên Máy đếm tế bào dòng chảy theo phổ.

Việc lựa chọn fluorochrome là một thách thức lớn, do sự khác biệt về độ phân giải và nhiễu tràn có thể ảnh hưởng đến hiệu suất panel và cách diễn giải dữ liệu. Lỗi lan truyền tín hiệu (SE) có thể gây khó khăn trong việc phân biệt chính xác giữa quần thể âm và dương trong cùng một đầu dò. Thiết kế panel hiệu quả sẽ giảm thiểu tác động của SE, vì mức độ SE có thể thay đổi giữa các fluorochrome và đầu dò khác nhau. Cần tối ưu hóa cẩn thận để đảm bảo đo lường chính xác và tin cậy.

Các panel đếm tế bào dòng chảy theo phổ phổ có thể được đánh giá bằng máy tính thông qua phân tích chỉ số tương đồng để so sánh hai đặc điểm phổ. Mức độ tương đồng giữa các phổ phát xạ fluorochrome hoặc phổ autofluorescence có thể được đánh giá trên thang điểm từ 0 đến 1 (0: không giống nhau, 1: trùng khớp hoàn toàn) để giúp lựa chọn fluorochrome phù hợp. Các tài nguyên như FluoroFinder cho phép phân tích phổ phát xạ fluorophore tại nhiều bước sóng kích thích khác nhau, hỗ trợ xây dựng ma trận tương đồng phổ để đánh giá mức độ tương đồng giữa các fluorophore có thể sử dụng đồng thời trong một thí nghiệm phổ.

Ví dụ, trong một panel phổ mẫu (Hình 4), FITC và Brilliant Blue 515 có chỉ số tương đồng 0.99 – gần như trùng lặp phổ. Tuy nhiên, APC và Alexa Fluor 647 có độ chồng phổ là 0.86, cho thấy tuy hai fluorochrome này không thể sử dụng cùng nhau trong đếm tế bào dòng chảy truyền thống, nhưng chữ ký phổ riêng biệt của chúng giúp có thể phân biệt được trong đếm tế bào dòng chảy theo phổ. Ngoài ra, một thông số khác là chỉ số độ phức tạp giúp đánh giá tổng thể độ khó của thiết kế panel. Mục tiêu của việc đánh giá này là đảm bảo panel khả thi và giảm thiểu SE. Chỉ số độ phức tạp thấp đến trung bình cho thấy panel khả thi, còn chỉ số cao cho thấy panel phức tạp và có thể cần đơn giản hóa.

Hình 4. (A) Dấu hiệu phổ và ma trận độ tương đồng của 15 fluorochrome có thể được sử dụng đồng thời trong một thí nghiệm dòng chảy theo phổ. (B) Chỉ số tương đồng càng cao cho thấy mức độ chồng lắp phổ càng lớn, do đó cần cân nhắc kỹ hơn khi đưa chúng vào cùng một panel. Ngược lại, giá trị thấp thể hiện mức độ tương đồng phổ thấp hơn. (Nguồn: https://fluorofinder.com/)

2. Chuẩn bị mẫu và tầm quan trọng của việc lựa chọn tham chiếu phù hợp

Chuẩn bị mẫu

Chuẩn bị mẫu cho kỹ thuật đếm tế bào dòng chảy theo phổ đòi hỏi phải chú trọng đến việc giảm thiểu sự chồng lắp phổ và tối ưu hóa khả năng phân tích đa chỉ tiêu – khác với đếm tế bào dòng chảy truyền thống vốn thường xử lý ít chỉ tiêu hơn và có yêu cầu hiệu chỉnh huỳnh quang đơn giản hơn. Các bước chính bao gồm: lựa chọn chất chống đông phù hợp, cố định tế bào, nhuộm màu và rửa mẫu. Tối ưu hóa các bước này giúp tăng độ lặp lại và giảm nhiễu nền cũng như hiện tượng tự phát huỳnh quang.

Các yếu tố tiền phân tích như thu thập mẫu, tách và bảo quản tế bào có vai trò quan trọng trong việc tạo ra huyền phù đơn bào chất lượng cao và đảm bảo kết quả thực nghiệm đáng tin cậy. Việc đảm bảo tỷ lệ sống cao của tế bào, giữ nguyên các dấu ấn bề mặt và giảm thiểu mảnh vụn tế bào – thường đạt được qua nhiều bước rửa – rất quan trọng để có được dữ liệu chất lượng.

Để loại bỏ hồng cầu và mảnh vụn một cách hiệu quả, cần xác định quy trình ly giải tối ưu: không ly giải/không rửa, ly giải/không rửa hoặc ly giải/có rửa. Tránh ly giải quá mức để bảo toàn tính toàn vẹn mẫu và lựa chọn dung dịch ly giải một cách cẩn trọng. Sau khi ly giải, cần tối ưu hóa bước cố định hoặc thấm màng để nhuộm nội bào nhằm đảm bảo phát hiện dấu ấn hiệu quả và chất lượng nhuộm cao

Mẫu đối chứng tham chiếu

Đối chứng là yếu tố thiết yếu trong đếm tế bào dòng chảy theo phổ để đảm bảo khả năng giải phổ chính xác. Người dùng cần đưa vào đối chứng đơn sắc cho từng fluorochrome nhằm thu nhận dấu hiệu phổ đặc trưng. Ngoài ra, các đối chứng không nhuộm và đối chứng tự huỳnh quang cũng cần thiết để phân biệt tín hiệu thật khỏi nhiễu nền, đảm bảo kết quả chính xác. Các loại đối chứng sử dụng gồm:

Đối chứng đơn sắc: Nhằm tránh lỗi giải phổ và kết quả dương tính giả, mẫu đối chứng phải tái hiện đúng đặc tính phổ của mẫu nhuộm đa màu. Cần thử nghiệm cả trên tế bào và hạt bead để xác định đối chứng phù hợp nhất với từng fluorochrome.

Hình 5. Các điều kiện cần thiết của đối chứng đơn sắc trong đếm tế bào dòng chảy theo phổ

Đối chứng không nhuộm: Rất quan trọng để đo tín hiệu tự huỳnh quang tế bào – vốn thay đổi tùy theo loại tế bào và điều kiện sinh lý. Ngoài ra, còn giúp thiết lập ngưỡng phân cổng (gating) dựa trên tán xạ trước và bên. Sử dụng tế bào không nhuộm được xử lý theo điều kiện giống mẫu thực nghiệm giúp kỹ thuật giải phổ dễ dàng loại bỏ ảnh hưởng của phân tử huỳnh quang tự nhiên, từ đó tăng độ nhạy và khả năng phát hiện các quần thể tế bào có biểu hiện yếu.
Đối chứng thuốc nhuộm khả năng sống/chết tế bào: Giúp phân biệt tế bào sống và chết trong thí nghiệm, đảm bảo diễn giải dữ liệu chính xác bằng cách nhận diện tế bào chết – vốn có thể ảnh hưởng đến chất lượng dữ liệu.
Ngoài ra, nên sử dụng đối chứng không chức một fluorescence (FMO) khi thiết lập thí nghiệm lần đầu. Đối chứng isotype cũng có thể được sử dụng nếu phù hợp với mục tiêu nghiên cứu.

Thu nhận và xử lý dữ liệu

Máy đếm tế bào dòng chảy đo số lượng photon phát ra từ các chất huỳnh quang. Máy đếm tế bào dòng chảy theo phổ ghi nhận toàn bộ phổ huỳnh quang của từng tế bào bằng cách đo tín hiệu phát xạ trên toàn dải bước sóng của ánh sáng khả kiến. Sau khi thu nhận, tín hiệu điện được xử lý, khuếch đại và số hóa. Dữ liệu đa màu sau đó được chia thành nhiều kênh để phân tích từng fluorochrome. Việc xử lý dữ liệu trong đếm tế bào dòng chảy theo phổ có nhiều điểm khác biệt so với đếm tế bào dòng chảy truyền thống

Chuẩn bị mẫu

Mỗi fluorochrome thể hiện một phổ đặc trưng – ánh sáng phát ra được phân bố theo phổ. Dấu hiệu này được mô tả bằng đồ thị có trục tung là cường độ tín hiệu và trục hoành là mật độ sự kiện tại mỗi đầu dò. Gradient màu – từ đỏ (cường độ cao) đến xanh lam (cường độ thấp) – cho thấy sự phân bố tín hiệu huỳnh quang. Điều này cho phép phân biệt fluorochrome, kể cả những fluorochrome có phổ phát xạ chồng lắp. Khi so sánh dấu hiệu phổ của từ 2 fluorochrome trở lên, cần chuẩn hóa phổ và so sánh hình dạng tổng thể.

Hình 6. Đặc điểm phổ của thuốc nhuộm PE được thể hiện bằng mô-đun phát hiện phổ CytoFLEX mosaic sử dụng máy đếm dòng chảy có 6 laser và 88 đầu dò.

Xử lý dữ liệu – Giải phổ so với hiệu chỉnh huỳnh quang

Một trong những khác biệt chính giữa Đếm tế bào dòng chảy thông thường và Đếm tế bào dòng chảy theo phổ nằm ở cách tách riêng tín hiệu của từng fluorochrome khỏi các tín hiệu tương tự (Hình 7). Trong khi các hệ thống đếm tế bào dòng chảy thông thường sử dụng hiệu chỉnh huỳnh quang để điều chỉnh hiện tượng chồng phổ giữa các fluorochrome lân cận nhằm phân lập tín hiệu riêng biệt, thì các hệ thống đếm tế bào dòng chảy theo phổ sử dụng kỹ thuật giải tích phổ để tách cường độ ánh sáng thu được thành đóng góp phổ riêng biệt của từng fluorochrome.

Hình 7. Minh họa trực quan sự khác biệt giữa kỹ thuật hiệu chỉnh huỳnh quang trong đếm tế bào dòng chảy thông thường và kỹ thuật giải phổ trong đếm tế bào dòng chảy theo phổ. (A) Biểu đồ bên trái cho thấy phổ phát xạ chồng lắp của hai tín hiệu huỳnh quang (ví dụ, từ hai fluorophore khác nhau). Sau khi thực hiện hiệu chỉnh huỳnh quang (compensation), tín hiệu chồng lắp – như thể hiện tại kênh thu màu xanh dương – sẽ được điều chỉnh bằng cách giảm nhiễu do hiện tượng tràn phổ (spillover). (B) Biểu đồ bên trái thể hiện dữ liệu được thu nhận bởi một hệ thống đếm tế bào dòng chảy theo phổ, nơi quá trình giải phổ (unmixing) sử dụng số lượng kênh thu nhận nhiều hơn số fluorophore để giải tích tín hiệu. Kết quả thu được là các phổ riêng biệt được tách rõ ràng cho từng fluorophore.

Cả hiệu chỉnh huỳnh quang và giải phổ đều cần thiết để phân tích dữ liệu đa màu. Việc bù trừ sử dụng ma trận tràn tín hiệu, trong khi giải phổ sử dụng phổ tham chiếu để tính toán. Phổ phát xạ của từng fluorochrome được lưu trữ trong thư viện. Khi đo mẫu đầy đủ, tổng tín hiệu phát xạ là sự cộng hợp của các fluorochrome. Để xác định đóng góp riêng lẻ của từng fluorochrome, kỹ thuật giải phổ như bình phương tối thiểu hoặc bình phương tối thiểu có trọng số sẽ được áp dụng