Giới thiệu
Phân tích tế bào dòng chảy nano có nhiều ứng dụng nghiên cứu và hứa hẹn trong việc phát triển các công cụ chẩn đoán và hệ thống phân phối thuốc mục tiêu. Khả năng phân tích các hạt nano dựa trên đặc điểm của chúng mở ra những khả năng mới cho y học cá nhân hóa và y học nano.
Mặc dù đếm tế bào dòng chảy nano là một kỹ thuật mạnh mẽ với nhiều ưu điểm, nhưng nó cũng có những hạn chế, bao gồm độ nhạy phát hiện và độ phân giải kích thước. Các nhà nghiên cứu đã cố gắng giải quyết vấn đề này bằng cách kéo dài các máy đếm tế bào dòng chảy có sẵn đến giới hạn phát hiện thấp hơn, cải thiện các kỹ thuật làm sạch và thêm các bước làm sạch trong quá trình chuẩn bị mẫu, cũng như nhiều biện pháp kiểm soát thử nghiệm và các điểm kiểm tra trực giao.
Máy đếm tế bào dòng chảy CytoFLEX nano đưa kỹ thuật đếm tế bào dòng chảy kích thước nano lên một tầm cao mới, cho phép thiết kế các thí nghiệm một cách linh hoạt, nhờ 5 tham số phân tán bên và 6 kênh huỳnh quang. Tính nhất quán về hiệu suất được đảm bảo thông qua QC chi tiết và công cụ giám sát độ nhạy huỳnh quang, cũng như nhiều tùy chọn vệ sinh trên bo mạch. Ở đây chúng tôi trình bày một ví dụ về bảng 5 màu trên EV PPP (Huyết tương nghèo tiểu cầu) được phân lập từ những người hiến tặng khỏe mạnh.
Giao thức
Túi ngoại bào được chiết xuất từ huyết tương giảm tiểu cầu được chuẩn bị từ máu toàn phần thu thập trong bình chứa chân không K3-EDTA thông qua quá trình ly tâm ở tốc độ 160 xg trong 5 phút, sau đó là bước lọc 0,2 μm và sắc ký loại trừ kích thước (SEC) sử dụng qEV đơn 70 nm (Izon). Các phân đoạn từ 4 đến 12 đã được thử nghiệm trên máy phân tích CytoFLEX nano và một phân đoạn được chọn để tiến hành dựa trên lượng túi ngoại bào hiện có, để giúp đảm bảo pha loãng đủ cao sau khi nhuộm và để loại bỏ các tập hợp kháng thể và các chất gây ô nhiễm khác. Kháng thể được quay ở tốc độ 20.000 xg trong 10 phút ở nhiệt độ phòng để loại bỏ các tập hợp, và chuẩn độ kháng thể đơn được chạy và điều chỉnh cho sự tràn huỳnh quang. Hiệu chỉnh huỳnh quang được áp dụng cho mẫu, sử dụng ma trận hiệu chỉnh huỳnh quang
Hình 1. Cài đặt ma trận hiệu chỉnh và thu thập của phần mềm nano CytExpert.
Kết quả
Máy đếm tế bào dòng chảy CytoFLEX nano cho phép các nhà nghiên cứu phát hiện và phân giải hiệu quả các EV có nguồn gốc từ huyết tương thấp tới 70 nm (theo giới hạn được xác định bởi SEC qEV đơn lẻ 70 nm từ Izon). Máy phân tích này phát hiện và phân biệt nhiều hơn một tín hiệu FL trên các hạt EV PPP đơn lẻ, bao gồm PB, FITC, PE, APC và PC7, cho phép người dùng nhìn thấy ngay cả các quần thể dương tính nhỏ đối với các dấu hiệu có biểu hiện thấp, như tetraspanin CD63 và CD235a đối với nhiễm bẩn hồng cầu. Nó cho phép phát hiện rõ ràng mà không bị nhiễu bởi tiếng ồn nền của kháng thể. Mức độ nhạy này có thể mang lại lợi ích rất lớn cho nghiên cứu EV, vì hầu hết các máy đếm tế bào dòng chảy đều được biết là không thể phát hiện các EV có đường kính nhỏ hơn 100 nm.
Hình 2. 5-color panel trên EV PPP được phân lập từ mẫu hiến tặng khỏe mạnh.
A. Kiểm soát một màu cho CD81 PB, CD9 FITC, CD235a PE, CD63 APC và CD61 PC7.
B. mẫu nhuộm với panel cho thấy CD81, CD9 và độ dương tính CD63 thấp. CD235a cho thấy mức độ nhiễm bẩn tối thiểu bởi hồng cầu và EV có nguồn gốc từ tiểu cầu được xác định bởi CD61.
Trong khi đếm tế bào dòng chảy là một kỹ thuật cung cấp độ nhạy độc đáo và đặc tính hạt đơn lẻ, dữ liệu được thể hiện theo các đơn vị tùy ý. Khi việc sử dụng kỹ thuật đếm tế bào dòng chảy phát triển trong không gian này, các nhà nghiên cứu sẽ yêu cầu dữ liệu được thể hiện theo các đơn vị tuyệt đối như nanomet và huỳnh quang hòa tan tương đương trung bình. Để thực hiện được điều này, mỗi nhà nghiên cứu sẽ cần phải chọn một phương pháp thích hợp để xác định kích thước và độ phong phú của huỳnh quang từ mỗi hạt được phát hiện. May mắn thay, các công cụ mạnh mẽ như FCMpass1 đã tồn tại để hỗ trợ các nhà nghiên cứu trong việc tạo dữ liệu có thể so sánh theo thời gian và nhiều phương pháp trực giao.
Tham chiếu:
-
Welsh, JA et al. Phần mềm FCMPASS hỗ trợ chuẩn hóa tán xạ ánh sáng túi ngoại bào. Cytometry A 97, 569–581 (2019).
EN