Kính hiển vi điện tử truyền qua cryo-EM và nhiễu xạ là những phương pháp quan trọng để phân tích cấu trúc sinh học ở độ phân giải gần mức nguyên tử. Phần lớn các nghiên cứu xác định cấu trúc nguyên tử truyền thống được thực hiện thông qua kỹ thuật nhiễu xạ tia X tại các máy gia tốc synchrotron; các thí nghiệm này đòi hỏi các tinh thể protein lớn, có cấu trúc trật tự cao (kích thước từ 50–100 µm). Việc nuôi cấy các tinh thể như vậy là một trở ngại quan trọng, vì quá trình này tốn nhiều thời gian hoặc đôi khi không thể thực hiện được. Một số đường dẫn tia đặc biệt có thể phân tích tinh thể nhỏ tới khoảng 10–50 µm, tuy nhiên các tinh thể này dễ bị hư hại do bức xạ, khiến chúng bị phá hủy trước khi có thể thu được ảnh nhiễu xạ. Đối với việc phân tích các tinh thể rất nhỏ (kích thước dưới 1 μm), điện tử có ưu thế hơn tia X vì khả năng tương tác với vật chất mạnh hơn, do đó có thể tạo ra tín hiệu mạnh hơn.
Kỹ thuật nhiễu xạ điện tử vi tinh thể (MicroED) do đó rất phù hợp để phân tích các tinh thể nano nhỏ, giúp tạo ra các cấu trúc 3D có độ phân giải cao của các hợp chất hóa học nhỏ hoặc đại phân tử sinh học. Không giống như phương pháp nhiễu xạ tia X cần đến các thiết bị synchrotron chuyên dụng, các thí nghiệm MicroED có thể được thực hiện bằng thiết bị cryo-EM trong các phòng thí nghiệm tiêu chuẩn. Các nghiên cứu MicroED được tiến hành trong môi trường chân không, giúp giảm nhiễu nền, đồng thời điều kiện nhiệt độ lạnh sâu bảo vệ mẫu tinh thể nhạy cảm khỏi hư hại do bức xạ, vốn có thể khiến mẫu bị phân hủy nhanh chóng. Phương pháp này cũng rút ngắn đáng kể quá trình chuẩn bị mẫu, vì chỉ cần nuôi cấy các tinh thể có kích thước nanomet. Do kích thước quá nhỏ, các tinh thể này chỉ có thể được phân tích bằng MicroED, vì chúng quá nhỏ để có thể tạo nhiễu xạ bằng các phương pháp khác.
Thật không may, chính sự tương tác mạnh với vật chất lại là một hạn chế của kỹ thuật nhiễu xạ điện tử (ED), vì chùm electron chỉ có thể xuyên qua độ dày tinh thể vài trăm nanomet trước khi bị hấp thụ hoàn toàn. Đối với các tinh thể có kích thước trung bình (5–30 µm), tồn tại một khoảng cách giữa quy mô nanomet phù hợp với ED và quy mô micromet phù hợp với nhiễu xạ tia X synchrotron; để có thể phân tích các vi tinh thể này bằng electron, cần làm mỏng mẫu tinh thể đến độ dày thích hợp.
Kính hiển vi điện tử quét tích hợp chùm ion hội tụ lạnh (cryo-FIB/SEM) có thể được sử dụng để mài mẫu một cách chính xác; trong tài liệu ứng dụng này, chúng tôi mô tả cách thiết bị Thermo Scientific™ Aquilos™ 2 Cryo-FIB có thể được sử dụng để gia công vi tinh thể đến kích thước phù hợp cho phân tích MicroED (Hình 1).
Hóa kính các vi tinh thể
Vi tinh thể có thể được nuôi cấy bằng các phương pháp tiêu chuẩn và đặt lên lưới hiển vi điện tử (EM grid). Để làm hóa kính, lưới được thấm hút dung môi dư và nhúng nhanh vào ethane lỏng bằng hệ thống Thermo Scientific Vitrobot™. Hình 2 cho thấy ảnh tổng quan các vi tinh thể apoferritin dạng tứ giác đã được hóa kính trên EM grid. Có thể thấy rõ rằng các tinh thể này quá dày để có thể quan sát bằng kính hiển vi điện tử truyền qua cryo-TEM; sự tán xạ mạnh của chùm electron khiến không thể xuyên qua tinh thể một cách hiệu quả. Thiết bị Aquilos 2 Cryo-FIB có thể được sử dụng để làm mỏng các vi tinh thể xuống độ dày phù hợp cho nghiên cứu bằng MicroED.
Làm mỏng tinh thể kích thước micromet bằng kính hiển vi cryo-FIB/SEM
Trong một thí nghiệm cryo-FIB điển hình, lưới EM có chứa các vi tinh thể đã hóa kính sẽ được gắn vào một holder lạnh chuyên dụng bằng trạm nạp mẫu, sau đó được chuyển vào bệ giữ lạnh (khoảng -180 °C) bên trong kính hiển vi Aquilos 2. Các tinh thể mục tiêu được xác định bằng ảnh điện tử thứ cấp (xem Hình 2). Trong quá trình làm mỏng bằng chùm tia ion, một chùm ion hội tụ sẽ quét dần bề mặt mẫu vật; các ion va chạm vào bề mặt sẽ đánh bật các nguyên tử khỏi vị trí ban đầu thông qua hiện tượng va chạm. Quá trình này cho phép loại bỏ vật liệu lớp này qua lớp khác một cách tuần tự (Hình 3).
Để chuẩn bị một lát mỏng có khả năng truyền electron từ một vi tinh thể, chùm ion cần loại bỏ vật liệu ở phía trên và dưới vị trí mục tiêu (xem Hình 1, Bước 2). Quá trình làm mỏng bằng chùm ion được thực hiện trực tiếp trên lưới hiển vi điện tử, và mẫu có thể giữ nguyên tại đó để phân tích nhiễu xạ tiếp theo trong cryo-TEM. Phương pháp chuẩn bị “ngay trên lưới” này giúp tránh các bước thao tác bổ sung như lấy lát mỏng ra khỏi lưới (lift-out), vốn rất dễ làm hỏng lát mỏng cryo mỏng manh.
Hình 4 minh họa quá trình mài mòn để tạo lát cryo-lamella từ các tinh thể lysozyme. Quá trình bắt đầu bằng ảnh tổng quan của tinh thể mục tiêu đã được định hướng theo hướng chiếu của chùm ion (Hình 4a). Hai vùng hình chữ nhật — vùng phía trên và phía dưới — đánh dấu các khu vực sẽ bị loại bỏ, nằm hai bên vùng trung tâm sẽ được giữ lại để tạo lát mỏng. Sau khi quá trình bắn phá bằng chùm ion hoàn tất, phần còn lại là một lát cryo-lamella mỏng khoảng ~200 nm, được đỡ vững hai bên (Hình 4b). Ảnh chụp từ trên xuống của lát mỏng này cho thấy vùng trung tâm giờ đã trong suốt với electron, sẵn sàng cho phân tích bằng cryo-EM (Hình 4c).
Thu nhận dữ liệu MicroED từ các vi tinh thể đã được làm mỏng bằng cryo-FIB
Dữ liệu MicroED được thu nhận trên các kính hiển vi điện tử truyền qua cryo-TEM sử dụng điện áp trung bình (200–300 keV), với electron là chùm tia tới. Điều quan trọng là tinh thể sau khi được phay bằng cryo-FIB vẫn phải giữ được khả năng nhiễu xạ, điều này đã được chứng minh trong các lát mỏng chuẩn bị theo cách này (Hình 5).
Các lưới EM chứa các lát mỏng vi tinh thể đã hóa kính được nạp vào cryo-TEM (ví dụ: Thermo Scientific Glacios™, Talos™ hoặc Krios™) ở nhiệt độ nitơ lỏng, sau khi lấy ra từ hệ thống Aquilos 2 Cryo-FIB. Tại đây, các lát mỏng được xác định bằng ảnh ở độ phóng đại thấp (Hình 5a), và chất lượng nhiễu xạ của tinh thể được đánh giá bằng cách thu nhận ảnh nhiễu xạ ban đầu (Hình 5b). Hiện có hai phương pháp phổ biến để ghi lại ảnh nhiễu xạ:
- Ghi từng ảnh tĩnh, mỗi ảnh cách nhau một góc nghiêng nhất định của lưới (ví dụ: tăng dần từng 0,5°).
- Quay mâm mẫu liên tục với tốc độ không đổi (ví dụ: 0,3–0,5 độ mỗi giây) trong khi tín hiệu electron tán xạ được ghi lại liên tục bằng detector. Phương pháp phổ biến này gọi là “continuous rotation” (quay liên tục) và đã được chứng minh giúp thu được dữ liệu có độ đầy đủ cao và thống kê tinh chỉnh tốt.
Để ghi dữ liệu MicroED, cần sử dụng camera được tối ưu cho thu nhận dữ liệu nhiễu xạ liều thấp. Cả hai loại camera CCD (Charge-Coupled Device) và CMOS (Complementary Metal–Oxide–Semiconductor) đều đã được sử dụng trong MicroED, tuy nhiên, CMOS có ưu thế hơn do tốc độ đọc nhanh hơn nhiều và ít bị ảnh hưởng bởi hiện tượng quá tải tín hiệu (blooming). Trong nghiên cứu này, camera CMOS Thermo Scientific CETA-D™ đã được sử dụng nhờ độ nhạy cao, cho phép phát hiện đáng tin cậy các đỉnh nhiễu xạ cường độ yếu ở độ phân giải cao. Tỷ lệ tín hiệu/nhiễu cao giúp đo chính xác cường độ tích hợp của các đỉnh, là điều kiện tiên quyết để xác định cấu trúc ở độ phân giải cao.
Xác định cấu trúc từ vi tinh thể được làm mỏng bằng FIB
Lát mỏng từ tinh thể lysozyme có thể nhiễu xạ đến độ phân giải 1,9 Å. Để có dữ liệu nhiễu xạ đầy đủ hơn và cải thiện chất lượng, người ta thường thu nhiều bộ dữ liệu từ cùng một hoặc nhiều tinh thể khác nhau và sau đó gộp lại.
Dữ liệu nhiễu xạ điện tử (ED) có thể được xử lý bằng phần mềm tinh thể học tiêu chuẩn như DIALS và XDS để phân chỉ số, chuẩn hóa và gộp dữ liệu. Tuy nhiên, các phần mềm này cần được tối ưu hóa để sử dụng các hệ số tán xạ electron thay vì tia X. Mặc dù tập dữ liệu lysozyme không đồng hình hoàn toàn, nhưng vẫn có độ tương quan cao với dữ liệu nhiễu xạ tia X trước đây (CC = 74%). Hơn nữa, việc tinh chỉnh bằng phương pháp rigid-body đơn giản, không cần can thiệp thủ công (sử dụng phần mềm PHENIX), cho kết quả tương đương với dữ liệu từ nhiễu xạ tia X (ID PDB: 5WR9). Chất lượng dữ liệu có thể được đánh giá từ bản đồ thế electron ở độ phân giải 1,9 Å như thể hiện ở Hình 6. Việc giữ được nhiễu xạ ở độ phân giải cao cho thấy quá trình phay bằng cryo-FIB không làm hư hại cấu trúc bên trong của mạng tinh thể, và thông tin cấu trúc trong lát mỏng vẫn được bảo toàn nguyên vẹn.
Hệ thống thiết bị kết hợp cryo-FIB với MicroED
Gói thiết bị chuyên dụng cho MicroED của Thermo Scientific giúp các hệ thống cryo-TEM sẵn sàng cho các thí nghiệm nhiễu xạ điện tử (Hình 7), dù là hệ thống mới hay được cải tiến từ thiết bị hiện có. Gói này bao gồm:
- Camera CETA-D sử dụng công nghệ CMOS
- Phần mềm Thermo Scientific EPU-D™ dành cho việc sàng lọc và thu nhận dữ liệu tự động
- Tấm chắn tia trung tâm (beamstop) được tối ưu để che chính giữa chùm tia mà không làm mất các điểm nhiễu xạ độ phân giải thấp
- Bộ khẩu độ tối ưu, giúp giảm tối đa tín hiệu nền không mong muốn từ khu vực xung quanh tinh thể
- Bộ thông số quang học điện tử chuyên dụng, cho phép tối ưu hóa việc sử dụng camera đồng thời đảm bảo hình học mẫu–chùm tia tối ưu nhất
Vai trò của công nghệ cryo-FIB trong chuẩn bị mẫu cho MicroED
Việc sử dụng cryo-FIB để làm mỏng các tinh thể có kích thước trung bình đã mở rộng đáng kể phạm vi kích thước tinh thể có thể được phân tích bằng MicroED. Phương pháp này cũng giúp rút ngắn thời gian tìm kiếm các tinh thể nano phù hợp — thay vì chỉ chọn lọc những tinh thể nhỏ, giờ đây mọi tinh thể ở các kích thước khác nhau đều có thể được sử dụng sau khi được làm mỏng bằng kỹ thuật phay ion, giúp đơn giản hóa quy trình chuẩn bị mẫu. Các tinh thể lớn với độ dày vài micromet, vốn không phù hợp với MicroED, giờ đây có thể được làm mỏng xuống độ dày 100–300 nm nhờ cryo-FIB. Điều này cho phép xác định cấu trúc từ những tinh thể trước đây bị coi là quá lớn cho thí nghiệm điện tử. Vì nhiều phương pháp tạo tinh thể thường cho ra các tinh thể quá nhỏ cho nhiễu xạ tia X nhưng lại quá lớn cho MicroED, công nghệ cryo-FIB đã mở ra một dải mẫu mới có thể tiếp cận được. Do đó, kỹ thuật này đóng vai trò như một cầu nối giữa nhiễu xạ vi tinh thể bằng synchrotron và phân tích nhiễu xạ điện tử của tinh thể nano.
Minh Khang là nhà phân phối và nhập khẩu trực tiếp dòng sản phẩm Kính hiển vi điện tử đến từ hãng hãng Thermo Fisher
EN