Lợi ích
- Tự động hóa toàn bộ quy trình nuôi cấy tế bào 3D, từ thiết lập xét nghiệm đến sàng lọc, chụp ảnh và phân tích dữ liệu
- Tăng cường độ tin cậy trong các kết quả sàng lọc thuốc
- Cung cấp những thông tin có giá trị để phát hiện thuốc hiệu quả cao và ứng dụng trong y học chính xác.
Giới thiệu
Oksana Sirenko, Angeline Lim, Astrid Michlmayr, Emilie Keidel, Felix Spira, Krishna Macha, Cathy Olsen | Molecular Devices
Tìm kiếm thuốc chống ung thư hiệu quả và sự kết hợp thuốc là yếu tố quan trọng để thành công trong điều trị. Vì vậy, cần phải phát triển các phương pháp thử nghiệm hiệu quả thuốc để khám phá các mục tiêu điều trị mới khả thi. Các mô hình tế bào ung thư 3D, như tumoroids, đại diện cho cấu trúc và hành vi của các khối u, là công cụ có giá trị cao cho nghiên cứu ung thư và phát triển thuốc. Tuy nhiên, các quy trình nuôi cấy tế bào 3D thủ công tốn thời gian, dễ mắc lỗi và không nhất quán, khiến việc áp dụng cho việc sàng lọc thuốc quy mô lớn trở nên khó khăn.
Để đẩy nhanh và chuẩn hóa thử nghiệm spheroid, nhóm tác giả đã phát triển các phương pháp tự động hóa nuôi cấy tế bào 3D sử dụng Hệ thống nuôi cấy tế bào tự động CellXpress.ai™ để thực hiện tự động hóa các bước như xếp tế bào, nuôi cấy lại, thay đổi môi trường nuôi cấy, giám sát các tổ chức mô 3D trong phản ứng với điều trị hợp chất và thử nghiệm kết thúc. Trong nghiên cứu này, nhóm tác giả mô tả việc tự động hóa quy trình nuôi cấy tế bào ung thư đại trực tràng, nơi chúng tôi tự động hóa quá trình nuôi cấy và hình ảnh hóa các spheroid ung thư đại tràng 3D được hình thành từ dòng tế bào HCT116 trong các đĩa đính kèm thấp hình chữ U.
Tế bào HCT116 được phát triển trong môi trường nuôi cấy 2D và spheroid được hình thành sau khi tự động phân phối huyền phù tế bào vào các đĩa 96 hoặc 384 giếng hình chữ U. Sau 48 giờ, các spheroid được điều trị với nhiều hợp chất chống ung thư ở các nồng độ khác nhau trong 3-5 ngày, sau đó được nhuộm và hình ảnh hóa. Việc xếp tế bào, thêm hợp chất, thay đổi môi trường và nhuộm được thực hiện tự động bởi hệ thống CellXpress.ai. Trong quá trình tự động hóa nuôi cấy tế bào, các spheroid được giám sát bằng ánh sáng truyền qua để phân tích các thay đổi hình thái, bao gồm ức chế sự tăng trưởng và phân hủy spheroid. Để kiểm tra kết thúc, các spheroid được nhuộm bằng sự kết hợp của thuốc nhuộm nhân Hoechst và thuốc nhuộm tế bào sống Calcein AM và EtHD. Các spheroid sau đó được chụp ảnh và phân tích kích thước spheroid và điểm số tế bào sống-chết. Ngoài ra, nhóm tác giả đo lường hàm lượng ATP bằng thử nghiệm CellTiter-Glo. Kết quả phát quang được thu thập bằng máy đọc đĩa đa năng SpectraMax® iD3. Chúng tôi đã quan sát thấy sự giảm ATP phụ thuộc vào nồng độ, ức chế sự phát triển của spheroid và chết tế bào phản ứng với các hợp chất chống ung thư.
Phương pháp
Tự động hóa quy trình làm việc của organoid
Hệ thống nuôi cấy tế bào CellXpress.ai mới tự động hóa toàn bộ quá trình nuôi cấy tế bào với tủ ấm tích hợp, máy xử lý chất lỏng và quyết định dựa trên hình ảnh. Giải pháp tự động này quản lý quy trình nuôi cấy lại tế bào khắt khe bằng cách giám sát sự phát triển của các mẫu nuôi cấy tế bào thông qua hình ảnh định kỳ và phân tích, đồng thời sử dụng học máy để khởi động bước xử lý tiếp theo hoặc xử lý sự cố.
Giao thức nuôi cấy tế bào
Các spheroid 3D được hình thành từ tế bào HCT116 ung thư đại trực tràng (ATCC) sử dụng các đĩa 96 giếng hình chữ U, đính kèm cực thấp (Greiner). Các bước nuôi cấy tế bào bao gồm xếp tế bào, thay đổi môi trường, thêm hợp chất và nhuộm, cũng như hình ảnh và phân tích, đều được thực hiện bằng hệ thống CellXpress.ai. Hình ảnh spheroid được thực hiện trong quá trình nuôi cấy bằng ánh sáng truyền qua (TL) với độ phóng đại 4X. Hình ảnh thử nghiệm kết thúc được thực hiện với độ phóng đại 10X sử dụng hình ảnh huỳnh quang (FL) và phân tích kích thước organoid và cường độ của các dấu ấn tế bào sống dựa trên nhuộm với Calcein AM, EtHD và thuốc nhuộm nhân Hoechst. Phân tích trong TL được thực hiện bằng phần mềm IN Carta® Image Analysis Software’s SINAP model, và phân tích trong FL được thực hiện theo giao thức phân tích CME.
Hệ thống nuôi cấy tế bào tự động CellXpress.ai
- Bộ xử lý chất lỏng tự động
- Phần mềm lên lịch và phân tích
- Tủ ủ tự động
- Máy chụp ảnh tự động
Cho phép phát triển các giao thức phức tạp bao gồm nhưng không giới hạn:
- Nuôi cấy/tăng cường tế bào
- Chuyển giao tế bào
- Chụp ảnh và giám sát
- Lên kế hoạch và giao thức lên lịch
Tự động hóa thí nghiệm 3D spheroid/tumoroid
Mô tả ngắn gọn về giao thức spheroid
Giao thức bắt đầu từ huyền phù tế bào được đặt vào bể chứa sâu (chúng tôi sử dụng bể chứa 12 giếng). Huyền phù tế bào được phân phối vào các đĩa 96 giếng đáy U có độ bám dính thấp (Greiner hoặc Corning). Các đĩa được đưa vào tủ ấm và tiếp tục nuôi cấy với việc hình ảnh hóa mỗi 12h hoặc 24h bằng độ phóng đại 4x hoặc 10x, sử dụng ánh sáng truyền qua (TL). Phân tích hình ảnh được thực hiện tự động để phát hiện spheroid và đánh giá kích thước và mật độ.
Thêm hợp chất: Sau 48 giờ nuôi cấy, 50µl môi trường được loại bỏ và 50µl dung dịch hợp chất với nồng độ gấp đôi được thêm vào theo giao thức “môi trường khác”. Các hợp chất đã được pha loãng trước trong khối 96 giếng sâu, sau đó mỗi hợp chất được thêm từ một cột đơn vào 4 cột của đĩa 96 giếng. Mỗi hợp chất được thêm vào theo từng bước riêng biệt với việc xác định bản đồ đĩa cho mỗi hợp chất và kích hoạt bước thêm hợp chất.
Nhuộm spheroid: Sau 3 ngày, organoid được nhuộm bằng dung dịch 3 thuốc nhuộm tế bào sống đã được pha sẵn. Việc nhuộm được thực hiện như một bước thay đổi môi trường. Quan trọng: để tránh nhiễm chéo, đầu bơm cần được loại bỏ và không thể tái sử dụng. Quá trình nhuộm được thực hiện trong tủ ấm trong 1 giờ. Bước rửa (1 bước có vẻ đủ) được thực hiện qua giai đoạn bổ sung môi trường với PBS.
Hình ảnh spheroid: Hình ảnh spheroid được thực hiện theo giao thức đã định nghĩa sẵn với DAPI, FITC, TexasRed. 10-15 bước, cách nhau 10-15 µm, với độ lệch 50-100, Z-stack xung quanh tiêu điểm. Các hình ảnh với tiêu điểm tốt nhất được sử dụng để phân tích. Giao thức phân tích CME trong phần mềm IN Carta® Image Analysis Software được sử dụng để xác định kích thước spheroid và cường độ của các kênh khác nhau. Các thay đổi về diện tích spheroid và cường độ trung bình, cũng như tỷ lệ cường độ sống/chết trung bình, được sử dụng để đánh giá tác động của hợp chất. Để có đặc trưng hình thái chi tiết hơn, hệ thống ImageXpress® Micro Confocal được khuyến nghị.
Quy trình nuôi cấy và phân tích spheroid tự động
- Quy trình này phù hợp cho các xét nghiệm spheroid ung thư
- Cũng áp dụng cho organoid tim, neuro-spheroid
Các bước chính của quy trình spheroid:
1. Tế bào được cấy vào đĩa U-ULA (Ultra-Low Attachment)
- Dung dịch tế bào trong môi trường được hút từ bể chứa sâu và pipet
- Nuôi cấy 100µL chứa 10,000 tế bào vào các đĩa 96 giếng đáy U (Greiner)
2. Hình thành spheroid
- Chuyển vào tủ ấp trong 48 giờ
- Giám sát quá trình hình thành spheroid bằng cách chụp ảnh
- Bộ quy trình toàn diện được thiết lập theo các “giai đoạn” do người dùng định nghĩa:
- Gieo cấy, nuôi cấy/giám sát, nhuộm, chụp ảnh
- Mỗi bước xác định các thuộc tính chính (đĩa nguồn và đích, giao thức pipet, thể tích, môi trường nuôi cấy, cài đặt chụp ảnh, giao thức phân tích)
- Các bước chính có thể được điều chỉnh bằng cách tinh chỉnh các tham số, cho phép tối ưu hóa thêm
- Quyết định cho quy trình có thể được thực hiện tự động dựa trên phân tích hình ảnh
3. Thay đổi môi trường nuôi cấy
- Loại bỏ môi trường nuôi cấy cũ
- Thêm môi trường nuôi cấy mới
- Quy trình được thiết lập để thay đổi môi trường định kỳ sau mỗi “X” giờ
4. Giám sát, chụp ảnh
- Việc chụp ảnh định kỳ của đĩa được định nghĩa bởi người dùng
- Phân tích hình ảnh ngay lập tức được thực hiện bằng cách sử dụng mô hình học sâu đã được huấn luyện sẵn hoặc giao thức tùy chỉnh
- Công cụ phân tích dữ liệu cho phép theo dõi sự phát triển của organoid theo thời gian
- Nhuộm organoid và rửa được thực hiện bằng cách sử dụng bước giao thức “thay đổi môi trường nuôi cấy”
- Chụp ảnh huỳnh quang (FL) của spheroid được thực hiện sau khi điều trị với hợp chất và nhuộm bằng Calcein AM, MitoTracker và Hoechst nuclear stain
5. Nhuộm và thử nghiệm với hợp chất hóa học
- Spheroids được chụp bằng CellXpress với các kênh DAPI, FITC và Texas Red, vật kính 10X hoặc 4X. Phân tích hình ảnh được thực hiện bằng CME (IN Carta).
- Hoechst – Blue
- Calcein AM – Green
- EtHD – Red
Kết quả
Đánh giá đặc tính của tác động hợp chất
Nhóm tác giả đã minh họa quy trình giúp hình thành spheroid/tumoroid bằng ví dụ từ tế bào ung thư đại tràng HCT116. Các spheroid được hình thành và duy trì bằng cách nuôi cấy tự động qua hệ thống CellXpress.ai. Sau khi điều trị hợp chất trong 3 ngày với các hợp chất chống ung thư (staurosporine, doxorubicin, paclitaxel), các spheroid được nhuộm bằng thuốc nhuộm tế bào sống Calcein AM và EtHD (tế bào chết), cùng với thuốc nhuộm nhân Hoechst. Các spheroid được hình ảnh hóa sử dụng các kênh huỳnh quang phù hợp DAPI, FITC và Texas Red, với các hình ảnh chiếu tiêu điểm tốt nhất từ Z-stack của hình ảnh được chụp ở độ phóng đại 10X. Cường độ huỳnh quang và tỷ lệ nhuộm sống/chết được đánh giá. Hình 5 cho thấy sự giảm tỷ lệ cường độ marker sống/chết với nồng độ hợp chất tăng lên. Thêm vào đó, sự giảm khả năng sống của tế bào được đánh giá qua thuốc thử CellTiter Glow (đo lường nội dung ATP). Sự giảm ATP được quan sát thấy khi nồng độ hợp chất tăng lên.
Tóm tắt
Có một nhu cầu lớn chưa được đáp ứng trong việc phát triển các phương pháp điều trị ung thư hiệu quả và cá nhân hóa hơn. Việc chuyển từ sinh học tế bào 2D sang 3D được coi là một bước đột phá trong mô hình ung thư và sàng lọc thuốc, vì mô hình 3D mô phỏng tốt hơn cấu trúc và chức năng mô, đồng thời cung cấp phản ứng dự đoán chính xác hơn với tác dụng của thuốc. Tuy nhiên, độ phức tạp của các giao thức nuôi cấy tế bào 3D đã cản trở việc nuôi cấy tế bào quy mô lớn và ứng dụng rộng rãi của chúng trong y sinh học.
Hệ thống nuôi cấy tế bào tự động CellXpress.ai giúp đơn giản hóa toàn bộ quy trình, từ nuôi cấy tế bào đến thiết lập thử nghiệm, sàng lọc, hình ảnh hóa tế bào và phân tích dữ liệu. Do đó, tự động hóa giúp các quy trình nuôi cấy tế bào 3D trở nên có thể tái tạo ở quy mô lớn, làm tăng độ tin cậy vào kết quả sàng lọc thuốc và tạo ra những hiểu biết cho khám phá thuốc tốc độ cao và các ứng dụng trong y học chính xác.
Minh Khang là nhà phân phối và nhập khẩu trực tiếp Hệ thống nuôi cấy tế bào đến từ hãng Molecular Devices
EN