Hướng dẫn và biện pháp kiểm soát: Khả năng tái tạo dữ liệu trong phân tích tế bào dòng chảy

Các hướng dẫn

Trong các thí nghiệm đếm tế bào dòng chảy, các tế bào được dán nhãn riêng lẻ chảy trong một dòng chất lỏng ổn định. Khi tế bào đi qua trước tia laser, nó khiến ánh sáng tán xạ theo cách có thể đo được và tương quan với kích thước tế bào. Đồng thời, tia laser kích thích các fluorophore liên kết với các kháng nguyên được dán nhãn trên các tế bào. Các fluorophore được kích thích phát ra các bước sóng ánh sáng riêng biệt có thể được sử dụng để phân biệt các kháng nguyên bề mặt được dán nhãn khác nhau hoặc các protein nội bào. Ngày nay, các máy đo lưu lượng tế bào có thể nhận dạng 20 hoặc nhiều fluorophore khác nhau và phát hiện nhiều thông số tế bào cùng một lúc.

Miễn dịch học là một trong những lĩnh vực đầu tiên áp dụng phương pháp đếm tế bào dòng chảy và nó vẫn đi liền với kỹ thuật này cho đến ngày nay. Lúc đầu, nhiều nhà miễn dịch học không hiểu cách sử dụng đầy đủ công cụ nghiên cứu mạnh mẽ này.

The problem was that if you asked someone how they did flow cytometry, which were the controls, how they did the controls, the staining, and all the steps, the answers were horrible. It’s like to drive in Formula One and not to have the car license,

Để giải quyết những câu hỏi này, Cossarizza và các đồng nghiệp của ông tại ISAC đã cùng nhau biên soạn hướng dẫn về cách sử dụng phương pháp đếm tế bào dòng chảy một cách chính xác trong lĩnh vực miễn dịch học vào năm 2017. ¹ Những hướng dẫn này, do một số tác giả từ cả học viện và ngành công nghiệp biên soạn, đã được các nhà nghiên cứu chấp nhận rộng rãi. Vào năm 2019, Cossarizza và ISAC đã đệ trình một bộ hướng dẫn mới, được cập nhật dành cho các nhà miễn dịch học. ² Những hướng dẫn này có thể áp dụng cho nhiều loại tế bào và lĩnh vực nghiên cứu. Cossarizza cho biết: “In the very beginning, it was for people doing immunology. But at the end, if you have to study lymphocytes, or if you have to study monocytes, or if you have to do leukemia, lymphoma, whatever, the technology is the same. You’re only changing the patient, the subject, the number of cells, but the technology is absolutely the same,”

Về mặt lâm sàng, Hiệp hội tế bào học lâm sàng quốc tế (ICCS) cũng tuân thủ một bộ hướng dẫn về tế bào học dòng chảy. ³ “Scientists are members of these societies and they have the expertise in how you manage a project,” Rudd Hulspas, giám đốc kỹ thuật phát triển quy trình tại Viện Ung thư Dana-Farber và là người sáng lập Cellular Technologies Bioconsulting, LLC cho biết.

Litwin, từ Caprion Biosciences, là chủ tịch của một nhóm liên ngành lớn khác với đại diện từ giới học thuật, ngành công nghiệp dược phẩm, phòng thí nghiệm lâm sàng, ngành sản xuất và chính phủ, đang tạo ra một bộ hướng dẫn đo lưu lượng tế bào phổ quát mới. Các hướng dẫn mới sẽ là một tài liệu của Viện Tiêu chuẩn Phòng thí nghiệm và Lâm sàng (CLSI), giúp các hướng dẫn này được công nhận rộng rãi hơn và có thẩm quyền hơn. ⁴

Các hướng dẫn mới dễ tiếp cận, với các cấp độ xác thực dữ liệu để đảm bảo khả năng tái tạo dữ liệu. Litwin và nhóm của cô khuyến nghị rằng mọi nghiên cứu đếm tế bào dòng chảy đều có một số cấp độ xác thực tương ứng với mục tiêu của nghiên cứu, với các nghiên cứu lâm sàng đòi hỏi nhiều bước xác thực hơn. Litwin khuyên rằng “If you’re a researcher, and you want to generate reproducible results, then you can get away with doing less, but you should characterize at a minimum, what’s the variability in the population,”

Biện pháp kiểm soát

Đếm tế bào dòng chảy đánh giá các tế bào một cách ngẫu nhiên. “Imagine that you have one cell positive in 1000. If you analyze, 2000 cells, you can find 1, 2, 3, 4, or 0. This means that you have to acquire a higher number of cells and you have to calculate the number of cells that you want and have to acquire according to some statistical low,”, Cossarizza cho biết. Các nhà nghiên cứu xác định giá trị thống kê thấp này hoặc số lượng tế bào tối thiểu cần thiết cho một thí nghiệm bằng cách thực hiện các thử nghiệm thống kê. Đặc biệt, các nhà nghiên cứu sử dụng đếm tế bào dòng chảy trên các quần thể hiếm thực hiện phân tích phân phối Poisson thống kê để thông báo số lượng tế bào họ cần thu thập để có thể tự tin vào dữ liệu của mình.

Trong đếm tế bào dòng chảy, các nhà nghiên cứu sử dụng huỳnh quang để xác định các kháng thể đặc trưng liên kết với tế bào. Việc lựa chọn huỳnh quang đáng tin cậy và sáng sẽ tăng cường độ tin cậy của việc đếm tế bào dòng chảy. Cossarizza cho biết: “If you want to detect rare cells, you need a very bright fluorochrome. If you want cells that are very common, I will say CD4 cells for example, you can use a fluorochrome which is not as brilliant as the others,” . Ông lưu ý rằng có những hướng dẫn quan trọng để lựa chọn huỳnh quang dựa trên loại tế bào mẫu. Để tránh xác định nhầm tế bào, các nhà nghiên cứu thực hiện các xét nghiệm sơ bộ trên các nhóm kháng thể để xác định huỳnh quang hoặc sự kết hợp của các huỳnh quang luôn cung cấp kết quả tốt nhất cho quần thể tế bào và điều kiện thử nghiệm của chúng.

Để đảm bảo độ tin cậy và thông báo các chiến lược gating, các nhà nghiên cứu thực hiện các thí nghiệm kiểm soát để kiểm tra kháng thể và chất huỳnh quang của họ. Họ cũng thường xuyên hiệu chuẩn các máy đếm tế bào dòng chảy

“The level of instruments is absolutely high. In this moment in my life, I have instruments from different companies, and I’m very happy with all of them. Every time that we analyze one sample, the same sample with different machines, the data are the same. This is what has to be,” Cossarizza cho biết.

Khi các nhà nghiên cứu biết loại máy đếm tế bào dòng chảy nào cần, họ có thể lập kế hoạch cho các thí nghiệm của mình theo đó để tối ưu hóa tính toàn vẹn của dữ liệu. Một số thiết bị phân tích các tế bào lớn hơn (lên đến 200 µm) hoặc phát hiện 50 phân tử huỳnh quang trên mỗi tế bào. Các thiết bị khác nhận dạng các tế bào nhỏ hơn (nhỏ hơn 80 nm) và phát hiện 200 phân tử trên mỗi tế bào. Cossarizza cho biết: “It depends on what you have to do. But I will say that for standard measures, if you don’t want to run a Ferrari, or if you don’t need to run a Ferrari on the highway, you can really run samples on all the machines today,”

Việc sử dụng các máy đếm tế bào dòng chảy khác nhau không có khả năng gây ra lỗi trong quá trình phân tích dữ liệu đo lưu lượng tế bào hạ lưu. Vào năm 1984, các chuyên gia đếm tế bào dòng chảy đã đặt ra các tiêu chuẩn dữ liệu để đảm bảo rằng đầu ra từ bất kỳ thiết bị nào của nhà cung cấp đều có thể được sử dụng với bất kỳ phần mềm phân tích nào ⁵. “They have a data standard file, whereas with other technologies, I don’t think you can do that,”, Litwin cho biết.

Để đảm bảo khả năng tái tạo dữ liệu đếm tế bào dòng chảy, các nhà nghiên cứu có thể thực hiện cả phân tích có giám sát và không giám sát. Nếu dữ liệu có thể tái tạo, cả hai kỹ thuật đều mang lại kết quả như nhau. Các nhà nghiên cứu cũng có thể yêu cầu một đồng nghiệp khách quan phân tích lại dữ liệu của họ.

Bảo vệ

Phương pháp đếm tế bào dòng chảy là một trong những tạp chí đầu tiên đặt ra các tiêu chuẩn cụ thể cho dữ liệu phân tích lưu lượng tế bào, nhưng nhiều tạp chí khác hiện yêu cầu các nhà nghiên cứu đăng các chiến lược gating và dữ liệu thô. Sau đó, các tạp chí này gửi tài liệu này để các nhà đánh giá phân tích lại. Một số tạp chí phân tích lưu lượng tế bào cũng yêu cầu các nhà nghiên cứu gửi dữ liệu thô của họ vào kho lưu trữ. Cossarizza cho biết  “If you put the files in a repository, everybody can control the data,”

I think there’s an important gatekeeper in flow cytometry and it is actually the journal

Lĩnh vực đếm tế bào dòng chảy vẫn đang phát triển. Máy đếm tế bào dòng chảy hiện nay nhận diện ngày càng nhiều chất huỳnh quang và phát hiện nhiều thông số tế bào cùng một lúc. Trong khi lĩnh vực phân tích lưu lượng tế bào tiếp tục phát triển, các chuyên gia vẫn khẳng định rằng các nguyên tắc cơ bản của nó vẫn giữ nguyên. Litwin cho biết: “What we put in [the guidelines] is foundational for anything that you do. So, if you’re doing 20 colors, you should still be looking at what we suggested for 8 or 18 colors and following those practices and then looking at how you can develop your best assay,”

Với thiết kế thử nghiệm cẩn thận và các thiết bị được hiệu chuẩn chính xác, phương pháp đếm tế bào dòng chảy là nguồn dữ liệu khoa học mạnh mẽ và đáng tin cậy.