Ứng dụng phương pháp đo PI trong hệ thống nuôi cấy vi sinh BioLector để xác định sự chết tế bào

Các phương pháp ứng dụng đo propidium iodide

Nhìn chung, nhuộm PI được thực hiện để đánh giá khả năng sống của tế bào trong các nuôi cấy vi khuẩn từ các sản phẩm thực phẩm, mẫu lâm sàng, quá trình lên men hoặc môi trường hoặc để mô tả đặc điểm của tế bào nhân chuẩn. ¹Trong các nghiên cứu vi sinh, các xét nghiệm khả năng sống của vi khuẩn là một công cụ phân tích quan trọng, được sử dụng rộng rãi để đánh giá các đặc tính kháng khuẩn như trong sàng lọc độc tính tế bào thông lượng cao hoặc trong các thử nghiệm độc tính thường được thực hiện bằng bộ dụng cụ nhuộm trộn sẵn, sẵn sàng sử dụng dựa trên phát hiện tính toàn vẹn của màng. Propidium iodide là một loại thuốc nhuộm đa năng, thường được sử dụng nhất để xác định các tế bào chết trong quần thể và làm thuốc nhuộm đối lập trong các kỹ thuật huỳnh quang nhiều màu. Nó được cho là chỉ thâm nhập vào các tế bào chết có màng tế bào bị phá vỡ và thường bị loại trừ khỏi các tế bào sống có màng tế bào nguyên vẹn và do đó không thể bị các hợp chất nhuộm thâm nhập.²

Thông qua việc xen kẽ với axit deoxyribonucleic tế bào (DNA), PI phát ra huỳnh quang màu đỏ. ¹ Nó liên kết với DNA giữa các bazơ với ít hoặc không có sự ưu tiên trình tự với một phân tử thuốc nhuộm trên bốn đến năm cặp bazơ, tương tự như ethidium bromide. Trong dung dịch nước, cực đại kích thích/phát xạ thuốc nhuộm của thuốc nhuộm là 493/ 636 nm. ³Sau khi thuốc nhuộm được liên kết, cực đại kích thích huỳnh quang được dịch chuyển khoảng 30-40 nm đến phạm vi bước sóng đỏ. Cực đại phát xạ huỳnh quang được dịch chuyển 15 nm đến phạm vi bước sóng xanh, tạo ra cực đại kích thích ở 535 nm và cực đại phát xạ huỳnh quang ở 617 nm như thể hiện trong hình 1. Tuy nhiên, với tỷ lệ tế bào chết so với tế bào sống ngày càng tăng, huỳnh quang PI màu đỏ tăng tuyến tính. ² PI cung cấp khả năng phân tích định lượng nhanh chóng và khả năng sử dụng rộng rãi trong nhiều thiết bị khác nhau: kính hiển vi huỳnh quang, kính hiển vi quét laser cộng hưởng, máy đo lưu lượng tế bào hoặc đầu đọc vi tấm.³

Hình 1: Phổ huỳnh quang của PI liên kết với DNA ⁴

Phương pháp

Nuôi cấy E. coli : Việc nuôi cấy E. coli Bl21 (DE3) diễn ra trong BioLector ở nhiệt độ nuôi cấy 37°C và tốc độ lắc 800 vòng/phút (rpm) và thể tích làm đầy 800 µL cho mỗi giếng trong mỗi giếng nuôi cấy của tấm vi chuẩn độ FlowerPlate ^® , loại BOH2 (MTP). Đối với môi trường nuôi cấy, sử dụng Wilms-MOPS với nồng độ đệm 50 mM hoặc 200 mM.

Nồng độ PI: Dung dịch gốc PI (Sigma Aldrich, 2019) được chuẩn bị bằng cách hòa tan 1 mM trong dung dịch đệm phosphat (PBS). Dung dịch gốc này cần được lọc vô trùng và bảo quản ở 4°C. Vì PI xen kẽ DNA, nên nồng độ PI cuối cùng trong môi trường nuôi cấy không được cao quá mức cần thiết để giảm nguy cơ gây nguy hiểm cho người dùng. Trong đơn xin lưu ý, nồng độ PI cuối cùng trong môi trường nuôi cấy là 5 µM. Đối với tín hiệu huỳnh quang chéo ít hơn, nên sử dụng môi trường nuôi cấy không màu.

Bắt đầu chết tế bào: Để gây ra cái chết của tế bào trong quá trình nuôi cấy mẫu này, nhiệt độ được đặt ở mức 50°C hoặc thêm methanol tinh khiết (MeOH) 7 giờ sau khi bắt đầu nuôi cấy.

Xác định tế bào chết: Sau khi tế bào chết, PI xâm nhập vào màng tế bào bị phá vỡ và liên kết với DNA dẫn đến sự dịch chuyển huỳnh quang. Sau đó, tín hiệu được phát hiện bởi mô-đun lọc PI.

Mô-đun lọc PI: Để xác định thành công các tế bào chết trong BioLector, mô-đun lọc PI (ID bộ lọc: 432) với đỉnh kích thích là 532 nm và đỉnh phát xạ là 620 nm là bắt buộc.

Kết quả

Sau đây là một số ví dụ khác nhau về việc sử dụng phương pháp phát hiện tế bào chết trong BioLector Pro với sự hỗ trợ của phương pháp nhuộm PI

Tín hiệu huỳnh quang nền: Một thí nghiệm tiền nuôi cấy (xem hình 2) cho thấy sự phát triển của vi khuẩn bị suy yếu tối thiểu bởi 5 µM PI so với nuôi cấy không nhuộm ( kiểm soát E. coli ), dẫn đến pha trễ dài hơn + 0,5 giờ có thể nhìn thấy trong ánh sáng tán xạ cũng như trong tín hiệu oxy hòa tan (DO). Hơn nữa, có thể quan sát thấy tín hiệu chéo huỳnh quang nền PI trong nuôi cấy không nhuộm và tín hiệu PI nền tăng lên trong nuôi cấy được xử lý bằng PI. Điều này có thể do huỳnh quang của các chất chuyển hóa khác trong quá trình phát triển. Mặt khác, PI hòa tan cũng có thể xuyên qua màng tế bào của tế bào sống. Sự phá vỡ màng xảy ra ví dụ thông qua phân chia tế bào, tổng hợp thành tế bào hoặc do tổn thương trong điều kiện stress. Do đó, có thể thấy sự gia tăng tín hiệu PI trong quần thể tế bào sống theo thời gian. ²Luôn phải xem xét tín hiệu nền này để tránh việc các tế bào sống bị phát hiện không chính xác là tế bào chết. Để so sánh tốt hơn tác động của các yếu tố gây căng thẳng khác nhau (MeOH hoặc sốc nhiệt), các yếu tố gây căng thẳng được áp dụng trong cùng một thời gian nuôi cấy (7 giờ) trong tất cả các thí nghiệm.

Hình 2: Thí nghiệm tiền nuôi cấy cho thấy tác động của 5 µM PI lên sự phát triển của vi khuẩn, DO và tín hiệu PI của quá trình nuôi cấy vi khuẩn trong lò phản ứng vi sinh BioLector. Nuôi cấy từng mẻ E. coli BL21 kiểu hoang dã trong Wilms-MOPS (chứa 10 g/L glycerol). Quá trình nuôi cấy diễn ra trong đĩa vi mô FlowerPlate ^® (MTP-48-BOH2) với V0 = 800 µL và n = 800 vòng/phút ở 37 °C. Kết quả cho thấy giá trị trung bình của bộ ba sinh học với các hệ số biến thiên (CV) sau: Đối với tín hiệu ánh sáng tán xạ: 0,58% đối với đối chứng E. coli và 0,44% đối với E. coli 5 µM + PI. Đối với tín hiệu DO: 0,50% đối với đối chứng E. coli và 0,56% đối với E. coli 5 µM + PI. Đối với tín hiệu PI: 5,99% đối với kiểm soát E. coli và 3,85% đối với E. coli 5µM +PI

Sàng lọc độc tính tế bào: Một ứng dụng bổ sung của nhuộm PI và phát hiện trong BioLector là sàng lọc độc tính tế bào. Trong ví dụ tiếp theo, nuôi cấy E. coli BL21 (DE3) bị căng thẳng bằng cách bổ sung MeOH, như thể hiện trong hình 3.

Hình 3: Sàng lọc độc tính tế bào sử dụng các nồng độ MeOH khác nhau làm yếu tố gây căng thẳng cho nuôi cấy E. coli . Nuôi cấy từng mẻ E. coli BL21 kiểu hoang dã trong Wilms-MOPS (với 10 g/L glycerol), thêm MeOH với 9% _v/v hoặc 27% _v/v ở nồng độ cuối cùng. Nuôi cấy diễn ra trong FlowerPlate ^® MTP (MTP-48-BOH2) với V ₀ = 800 µL và n = 800 vòng/phút ở 37 °C. Kết quả cho thấy giá trị trung bình của bộ ba sinh học với CV sau: Đối với ánh sáng tán xạ: 5,33% đối với đối chứng E. coli và 7,09% đối với E. coli 5 µM + PI. Đối với DO: 0,51% đối với đối chứng E. coli và 1,24% đối với E. coli 5 µM + PI. Đối với tín hiệu PI: 4,27% đối với kiểm soát E. coli và 4,07% đối với E. coli 5 µM +PI.

Sau 7 giờ nuôi cấy, việc bổ sung 27% _v/v MeOH đã làm chậm sự phát triển, có thể phát hiện được trong tín hiệu ánh sáng tán xạ và trong DO: Tín hiệu DO tăng lên giá trị ban đầu (100%) ngay sau khi bổ sung MeOH, cho thấy sự khởi đầu của quá trình chết tế bào. Việc bổ sung 9% _v/v MeOH dẫn đến sự chậm lại trong tín hiệu ánh sáng tán xạ, cho thấy độ dốc của sự phát triển giảm tương quan với tín hiệu DO. Ví dụ, trong hình 2, các tế bào đối chứng đạt đến giới hạn O2 do tốc độ tăng trưởng nhanh so với các tế bào bị căng thẳng với 9% _v/v trong hình 3. Tín hiệu PI cuối cùng sau 18 giờ là 2,54 au đối với 27% _v/v MeOH và 1,57 au đối với các tế bào được xử lý bằng 9% _v/v MeOH. Các giá trị được làm trống so với môi trường chứa 5 µM PI.

Điều quan trọng cần lưu ý là tín hiệu này là giá trị tương đối và phụ thuộc rất nhiều vào thời điểm đo và số lượng tế bào cuối cùng do thời gian tiếp xúc của tế bào với PI và do đó các tín hiệu nền nêu trên tăng theo thời gian. Do đó, xử lý MeOH và xác định PI phải luôn được thực hiện tại cùng một thời điểm.

Xác định sự phân hủy tế bào: Phép đo PI trong BioLector có thể là một công cụ hữu ích để xác định sự phân hủy tế bào trong quá trình thí nghiệm nuôi cấy. Trong ví dụ sau, sự phân hủy tế bào được gây ra bằng cách tăng nhiệt độ nuôi cấy từ 37° C lên 50° C sau 7 giờ như thể hiện trong hình 4. Tín hiệu ánh sáng tán xạ không cho thấy sự phát triển thêm đối với E. coli có 5 µM PI và cũng như đối với chủng kiểm soát một giờ sau khi bắt đầu xử lý nhiệt. Đường cong tăng trưởng của E. coli (+ 5 µM PI) mà không xử lý nhiệt cho thấy sự tăng trưởng theo cấp số nhân cho đến khi pha tĩnh bắt đầu sau 11 giờ. Với thời gian trễ là 2 giờ sau khi xử lý nhiệt, các tế bào bắt đầu phân hủy và do đó tín hiệu PI tăng tuyến tính và bão hòa vào khoảng 14 giờ sau thời gian nuôi cấy. Thời gian trễ là 2 giờ là do thời gian nhiệt cần phân phối trong chất lỏng và tác động vào các tế bào. Đối với đường cong PI của chủng không xử lý nhiệt, có thể thấy tín hiệu huỳnh quang nền trong pha tăng trưởng theo cấp số nhân.

Hình 4: Xác định sự phân hủy tế bào trong BioLector bằng cách nhuộm PI. Nuôi cấy từng mẻ E. coli BL21 kiểu hoang dã trong Wilms-MOPS (chứa 10 g/L glycerol). Nuôi cấy diễn ra trong FlowerPlate ^® MTP (MTP-48-BOH2) với V ₀ = 800 µL và n = 800 vòng/phút ở 37 °C. Kết quả cho thấy giá trị trung bình của bộ ba sinh học có CV như sau: Đối với tín hiệu ánh sáng tán xạ: 1,86% đối chứng E. coli , 1,49% đối với E. coli 5 µM+PI và 0,44% đối với E. coli 5 µM+PI (không xử lý nhiệt) và đối với tín hiệu PI: 6,75% đối chứng E. coli và 3,96% đối với E. coli 5 µM +PI và 3,85% đối với E. coli 5 µM+PI (không xử lý nhiệt).

Xác định các tế bào trong điều kiện stress. Sự kết hợp của ánh sáng tán xạ và tín hiệu PI hữu ích để xác định các tế bào bị căng thẳng trong một thí nghiệm nuôi cấy đang chạy. Trong ví dụ sau, E. coli BL21 được nuôi cấy trong môi trường Wilms-MOPS sử dụng hai nồng độ đệm MOPS khác nhau. Trong hình 5, kết quả thí nghiệm liên quan đến ánh sáng tán xạ, DO, pH và PI được biểu diễn theo thời gian nuôi cấy.

Hình 5: Xác định các tế bào bị căng thẳng bằng phép đo PI trong BioLector^® Pro. Nuôi cấy hàng loạt E. coli BL21 kiểu hoang dã trong Wilms-MOPS (với 10 g/L glycerol) được đệm bằng 50 mM MOPS hoặc 200 mM MOPS, diễn ra trong FlowerPlate ^® MTP (MTP-48-BOH2) với V0 = 800 µL và n = 800 vòng/phút ở 37 °C. Kết quả cho thấy giá trị trung bình của bộ ba sinh học với CV như sau: Đối với ánh sáng tán xạ: 0,57% đối với E. coli 5 µM+PI (đệm 50 mM), 0,45% đối với E. coli 5 µM+PI (đệm 200 mM), đối với pH: 0,17% đối với E. coli 5 µM+PI ( đệm 50 mM) và 0,26% đối với E. coli 5 µM+PI (đệm 200 mM), đối với DO: 1,08% đối với E. coli 5 µM+PI (đệm 50 mM) và 2,14% đối với E. coli 5 µM+PI (đệm 200 mM) và đối với tín hiệu PI: 2,93% đối với E. coli 5 µM+PI (đệm 50 mM) và 3,66% đối với E. coli 5 µM+PI (đệm 200 mM).

Đường màu xanh lam đậm biểu thị kết quả nuôi cấy trong môi trường đệm Wilms-MOPS 200 mM và đường nét đứt của môi trường đệm 50 mM. Nếu chỉ tập trung vào tín hiệu sinh khối, có thể cho rằng sinh khối tăng lên các giá trị cao hơn trong môi trường đệm 50 mM so với môi trường đệm 200 mM. Tuy nhiên, tín hiệu PI và DO lại cho thấy kết quả ngược lại. Do đó, không phải do sinh khối mà là các hạt giải phóng vào môi trường do sự phá vỡ tế bào. Giá trị pH của môi trường đệm thấp hơn giảm nhanh xuống dưới pH 5,5 và do đó xuống dưới phạm vi pH tối ưu trong giai đoạn tăng trưởng theo cấp số nhân từ 5 đến 9 giờ. Điều này dẫn đến sự dừng tăng trưởng được xác nhận bởi tín hiệu DO tăng vọt sau 9 giờ ngay khi pH giảm xuống dưới pH 5,5. Do đó, DO nhảy vọt lên giá trị ban đầu là 100%. Ngược lại, pH trong môi trường đệm 200 mM ổn định hơn. Trong giai đoạn tăng trưởng theo cấp số nhân, nó giảm từ pH 7,3 xuống 6,5 sau 9,5 giờ. Về tín hiệu DO, có thể thấy sự dịch chuyển diauxic tại thời điểm nuôi cấy 10 giờ. Ở đây, E. coli đang tiêu thụ acetate được tạo ra dẫn đến sự gia tăng chậm hơn của DO về phía cuối quá trình nuôi cấy. Hơn nữa, độ pH tăng lên đến pH 6,7. Nhìn chung, độ pH tối ưu có thể được đảm bảo trong toàn bộ quá trình nuôi cấy theo mẻ dẫn đến tình trạng tốt hơn của vi khuẩn trong môi trường đệm 200 mM so với môi trường đệm thấp hơn. Tín hiệu PI cho thấy tín hiệu cao hơn nhiều của nuôi cấy đệm thấp so với nồng độ đệm 200 mM. So với nuôi cấy đệm cao, tín hiệu PI của nuôi cấy đệm thấp tăng theo cấp số nhân sau 11 giờ nuôi cấy do sự phá vỡ tế bào gây ra bởi độ pH thấp như một yếu tố gây căng thẳng. Vào cuối quá trình nuôi cấy, giá trị này cao hơn 2,5 lần so với tín hiệu nền của nuôi cấy đệm 200 mM. Với thông tin của tín hiệu ánh sáng tán xạ kết hợp với tín hiệu PI, có thể kết luận rằng sự phát triển trong môi trường đệm 50 mM không tốt hơn. Tuy nhiên, chúng ta có thể theo dõi quá trình phân hủy tế bào vào cuối quá trình nuôi cấy. Sự phân hủy này dẫn đến sự gia tăng các mảnh vỡ trong môi trường nuôi cấy và do đó làm tăng tín hiệu ánh sáng tán xạ cũng như tăng tín hiệu PI do có sẵn DNA tự do.

Kết luận

Ghi chú ứng dụng này trình bày các ví dụ ứng dụng mở rộng sử dụng phương pháp nhuộm PI trong BioLector để xác định các tế bào chết hoặc tế bào stress trong quá trình nuôi cấy đang chạy. Vẫn còn nhiều khả năng phát triển như hiệu chuẩn tín hiệu thô PI với số lượng tế bào chết. Hơn nữa, thử nghiệm khả năng sống/chết có thể được phát triển trong tương lai bằng cách sử dụng các mô-đun bộ lọc bổ sung để đo tỷ lệ tế bào sống, cho phép đo tỷ lệ số liệu của các tế bào chết/sống liên quan đến tổng số lượng tế bào.

Tài liệu tham khảo

[1] Krämer, C., et al.: Phân tích tế bào đơn lẻ, phân giải theo thời gian về cái chết của tế bào được gây ra và được lập trình thông qua propidium iodide không xâm lấn và truyền thuốc nhuộm đối lập. Báo cáo khoa học, 2016.

[2] Stiefel, P., et al.: Q.: Các khía cạnh quan trọng của việc sử dụng xét nghiệm khả năng sống của tế bào vi khuẩn với các chất huỳnh quang SYTO9 và propidium iodide. BioMed Central, 2015. [3] Nhuộm axit nucleic propidium iodide, https://assets.thermofisher.com/TFSAssets/LSG/manuals/mp01304.pdf (05.09.2018), Molecular Probes™, 2006.

[3] https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/V13241?SID=srch-srpV13241 , ThermoFischer Scientific, 2019.

 

Nguồn: https://www.mybeckman.vn/resources/reading-material/application-notes/determination-of-cell-death-in-the-biolector-ii-pro