Giới thiệu

Kể từ nghiên cứu liệu pháp gen đầu tiên vào cuối những năm 1980, các chiến lược liệu pháp gen vẫn luôn được quan tâm. Theo báo cáo của Ginn và cộng sự (1), vào năm 2018 đã có khoảng 2.600 thử nghiệm lâm sàng về liệu pháp gen đang được tiến hành, hoàn tất hoặc đã được phê duyệt. Trong đó, phần lớn các thử nghiệm tập trung vào điều trị ung thư, tiếp theo là các bệnh đơn gen và bệnh truyền nhiễm (Bảng 1). Nhìn chung, các liệu pháp gen có thể được chia thành hai nhóm: hệ thống dẫn truyền không dùng virus và dùng virus. Hệ thống không dùng virus thường được đặc trưng bởi khả năng xâm nhập tế bào không định hướng, hiệu suất thấp, và chỉ biểu hiện gen tạm thời. Tuy nhiên, chúng lại có những ưu điểm như dung tích mang gen lớn hơn và hồ sơ an toàn sinh học tốt hơn so với liệu pháp gen sử dụng virus (1). Ngược lại, các hệ thống sử dụng virus có hiệu suất dẫn truyền cao, do tận dụng được các cơ chế sinh học tự nhiên của virus như khả năng xâm nhập tế bào chủ và sử dụng bộ máy sao chép của tế bào. Trong số các hệ thống virus được biết đến, adenovirus là loại được sử dụng nhiều nhất, tiếp theo là retrovirus và Virus liên hợp Adeno (AAV). Đáng chú ý, AAV đã thu hút nhiều sự quan tâm hơn trong những năm gần đây, trái ngược với xu hướng giảm của các loại virus khác (1). Một trong những lý do có thể là do AAV có tính sinh miễn dịch thấp hơn so với nhiều loại virus khác (2).

Thử nghiệm lâm sàng liệu pháp gen
Bệnh ung thư	65%
Bệnh di truyền đơn gen	11,1%
Bệnh truyền nhiễm	7%
Bệnh tim mạch	6,9%
Khác	10%
Bảng 1: Phân bố các thử nghiệm lâm sàng đã hoàn thành, đang diễn ra hoặc đã được phê duyệt theo danh mục bệnh năm 2018, tính bằng % (1)

Virus liên hợp Adeno (AAV)

AAV là một loại parvovirus không gây bệnh và không có màng bọc, với kích thước khoảng 22 nm, và không thể tự nhân lên nếu không có sự hỗ trợ của virus hỗ trợ như adenovirus hoặc herpes simplex virus (2). Vỏ capsid của virus có khả năng mang một gen ngoại lai (transgene) khoảng 5 kb, bao gồm cả các trình tự lặp lại đầu mút (ITR) của virus, mà không làm giảm đáng kể hiệu suất sản xuất virus (2). Một trình khởi động (promoter), gen mục tiêu, và trình kết thúc (terminator) được chèn vào giữa hai trình tự ITR này. Sau khi được xâm nhập vào tế bào (transduction), gen ngoại lai sẽ tồn tại dưới dạng episome (DNA ngoài nhiễm sắc thể) trong nhân tế bào – nơi diễn ra quá trình biểu hiện của gen. Việc gen tồn tại dưới dạng episomal giúp giảm nguy cơ tích hợp vào bộ gen vật chủ, tuy nhiên episome có thể bị pha loãng sau vài chu kỳ phân bào (3). Hiện nay có nhiều serotype (kiểu huyết thanh) của AAV được sử dụng làm vector cho liệu pháp gen. Các serotype này có tính hướng mô đặc hiệu (tissue-tropism), do đó giới hạn ứng dụng của chúng ở một số cơ quan nhất định. Nhiều nghiên cứu đang được thực hiện để tối ưu hóa cấu trúc capsid, nhằm điều chỉnh khả năng định hướng mô/cell (tropism) của virus đến các loại tế bào mục tiêu (4, 5).

Ví dụ 1: Kiểm soát chất lượng vector rAAV bằng phương pháp AUC

Do tính phổ biến và mức độ sử dụng ngày càng tăng, việc đánh giá chất lượng của các vector rAAV đạt chuẩn lâm sàng trước khi đưa vào sử dụng là vấn đề được đặc biệt quan tâm.

Burnham và các cộng sự (6) đã chỉ ra rằng các thí nghiệm siêu ly tâm phân tích vận tốc lắng có thể được sử dụng để đánh giá chất lượng của quá trình sản xuất vector virus (tỷ lệ giữa capsid rỗng và đầy). Một thí nghiệm AUC duy nhất có thể cung cấp cái nhìn sâu sắc về thành phần của DNA được bao gói, mức độ thành công của quá trình tinh sạch, sự hiện diện của các cấu tử kết tụ, cũng như tỷ lệ giữa các hạt virus rỗng, chứa một phần và chứa đầy. Các mẫu AAV được đo ở bước sóng 260 nm với tốc độ 20.000 vòng/phút (6). Một đỉnh ở 63S tương ứng với các capsid vector rỗng, trong khi đỉnh ở 93S biểu thị tỷ lệ capsid chứa đầy. Ngoài ra, còn có các đỉnh nằm giữa 63S và 93S, có thể là các capsid chứa một phần DNA, và cuối cùng là các đỉnh lớn hơn 93S, có thể là các hạt virus bị kết tụ. Hơn nữa, các nhà khoa học còn cố gắng đánh giá khả năng của AUC trong việc phân biệt các transgene có kích thước khác nhau. Trước hết, họ sử dụng một transgene dài 3370 nucleotide tạo ra một giá trị s khoảng 92 sau khi ly tâm, trong khi một transgene dài 4200 nucleotide tạo ra đỉnh có giá trị s là 101. Tổng kết lại, AUC là một công cụ hữu ích để phân tích các vector rAAV, bất kể thành phần, độ dài của transgene hay kiểu serotype của virus.

Ví dụ 2: Phân tích tốc độ lắng độ phân giải cao – tiêu chuẩn cho đánh giá các kỹ thuật bổ trợ

Trong ví dụ sau, Wang và các cộng sự đã nghiên cứu tiềm năng của phương pháp sắc ký trao đổi anion (AEX) trong việc xác định các capsid AAV rỗng và đầy, cũng như các quần thể khác trong mẫu như capsid chứa một phần vật liệu di truyền (7). Họ cũng đề cập đến kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM) và một số kỹ thuật khác như ELISA kết hợp với qPCR như những phương pháp tiềm năng để kiểm tra chất lượng của AAV. Tuy nhiên, nhóm tác giả thừa nhận rằng AUC vẫn là tiêu chuẩn vàng trong việc phát hiện và đặc trưng hóa các hạt AAV. TEM không phải là phương pháp định lượng, chỉ cung cấp thông tin định tính về lô AAV được kiểm tra. Các phương pháp ELISA/qPCR và CDMS được chứng minh là không đủ chính xác để cung cấp độ phân giải phù hợp.

Cuối cùng, nhóm nghiên cứu đã so sánh trực tiếp AEX với AUC: AUC cho thấy độ phân giải cao hơn nhiều so với AEX – thể hiện rõ ở việc tách đường cơ sở giữa các capsid rỗng và đầy trong thí nghiệm AUC. Trong khi đó, thí nghiệm AEX tương ứng chỉ hiển thị các capsid rỗng dưới dạng vai chồng lên đỉnh chính của capsid đầy. Thí nghiệm AUC thậm chí còn phát hiện một quần thể nhỏ có thể là các capsid chứa genome bị phân mảnh – loại cấu tử này không thể quan sát được trong AEX (Hình 1).

Hình 1: Đặc trưng của capsid rỗng và đầy của AAV bằng phương pháp AEX và AUC (được sử dụng với sự cho phép từ Wang và cộng sự (7)). So sánh sắc ký đồ AEX (A) và phân bố hệ số lắng (sedimentation coefficient) AUC (B) của mẫu AAV6.2 tinh sạch bằng phương pháp ái lực. E: capsid rỗng; F: capsid đầy; P: capsid chứa hệ gen bị phân mảnh; X: thành phần chưa xác định. Tỷ lệ phần trăm đỉnh hiển thị trên biểu đồ là phần trăm diện tích (area percent) được xác định tại bước sóng UV 260 nm, chưa được hiệu chỉnh theo hệ số đáp ứng (response factor).

Trái ngược với AUC, mọi kỹ thuật sắc ký đều sử dụng một pha tĩnh (ma trận), mà các hạt phải đi qua. Do đó, không những các hạt có thể tương tác với ma trận, mà hiệu ứng pha loãng còn có thể làm tan các hạt AAV bị kết tụ, dẫn đến việc bóp méo bức tranh thực sự về lô virus. Trong khi đó, AUC là một phương pháp không sử dụng ma trận, cho phép đặc trưng hóa mẫu trong môi trường gần giống điều kiện tự nhiên nhất.

Optima AUC

• Kỹ thuật dựa trên nguyên lý đầu tiên không phụ thuộc vào ma trận và không yêu cầu tiêu chuẩn tham chiếu.
• Phân tích mẫu trong trạng thái gần như tự nhiên
• Chỉ với một thí nghiệm, có thể thu được nhiều thông tin, bao gồm:
  • Hình dạng
  • Đường kính
  • Khối lượng
  • Tỉ lệ thành phần (stoichiometry)
  • Độ tinh khiết
  • Tính không đồng nhất của chế phẩm
  • Sự kết tụ
  • Sự liên kết
  • Cấu dạng của protein hoặc phức hợp protein

• Hệ thống quang học:

  • Giao diện Rayleigh

  • Hấp thụ UV

• Thể tích mẫu:

  • Tối đa cho đĩa hai khoang (2-sector centerpieces): 450 μl

  • Tối đa cho đĩa cân bằng sáu kênh (6-channel equilibrium centerpieces): 120 μl

• Dải bước sóng khả dụng: 190 – 800 nm

• Dải khối lượng phân tử:

  • Từ 10² Da (ví dụ: peptide/oligosaccharide)

  • Đến 10⁸ Da (ví dụ: virus/bào quan)

• Dải nồng độ:

  • Hấp thụ UV: 0.005 – 1–2 mg/ml (ví dụ: Luteinizing Hormone)

  • Gây nhiễu bởi protein như BSA: 0.025 – 4–5 mg/ml

Dịch từ nguồn: https://www.mybeckman.vn/resources/reading-material/whitepapers/quality-of-aav-gene-therapy-vectors-by-sedimentation-velocity-analysis

Minh Khang là nhà nhập khẩu và phân phối trực tiếp Thiết bị siêu ly tâm phân tích từ hãng Beckman Coulter